一种靶向促炎型巨噬细胞的工程化外泌体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种靶向促炎型巨噬细胞的工程化外泌体及其制备方法和应用，属于生物医学技术领域。所述外泌体的膜外表面负载靶向肽，膜内表面负载标记蛋白。经过工程化改造的外泌体可以对促炎型巨噬细胞进行活体示踪和显像等诊断性操作。同时由于其可以高效特异地靶向促炎型巨噬细胞，因此也可以为促炎型巨噬细胞递送治疗性介质，从而为如骨关节炎、类风湿性关节炎等炎性疾病提供一种高效、特异且安全的治疗策略。治疗策略。治疗策略。

【技术实现步骤摘要】
一种靶向促炎型巨噬细胞的工程化外泌体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物医学
，涉及一种靶向促炎型巨噬细胞的工程化外泌体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]促炎型巨噬细胞通常是由TNF
‑
γ、Toll样受体等诱导，产生一系列如TNF
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α、IL
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6和iNOS促炎因子，是骨关节炎、类风湿性关节炎以及骨、软骨损伤等多种炎性疾病的靶细胞。促炎型巨噬细胞与上述疾病的发生发展及疾病活跃程度密切相关，因此通过对促炎型巨噬细胞组织分布情况进行活体观测可作为相关疾病研究的重要依据。此外，在炎性疾病中，HIF
‑
1α是多种病理生理过程的调控信号，在多种生命活动中发挥关键的作用。例如HIF
‑
1α在关节软骨细胞中，具有促进软骨细胞存活、增殖，维持关节软骨基质代谢平衡等功能；然而在巨噬细胞中，其具有促进巨噬细胞炎症反应，从而导致滑膜炎症反应加重、关节疼痛、关节活动障碍，甚至加剧骨关节炎、类风湿性关节炎等炎性疾病中骨与关节软骨的破坏。研究表明，调控HIF
‑
1α水平可以用于炎性疾病治疗，然而广泛干预该信号会产生严重的副作用，从而限制其临床应用。靶向干预是常见的调控HIF
‑
1α水平的手段之一，靶向干预促炎型巨噬细胞HIF
‑
1α可避免无差别干预HIF
‑
1α可能引起的潜在不利影响，从而更好地发挥疾病治疗作用。目前采用的靶向材料为纳米粒子或化学合成材料，相较于纳米粒子、化学合成材料等靶向(或递送)材料，工程化外泌体具有高效、非预知毒副作用小以及适用性广等优势，但是目前尚无有关利用工程化外泌体实现促炎型巨噬细胞靶向操作及治疗性介质递送的报道。
[0003]因此，为了对促炎型巨噬细胞进行活体示踪和显像，从而便于相关疾病的研究，同时弥补尚无工程化外泌体靶向作用促炎巨噬细胞，从而将干预促炎型巨噬细胞HIF
‑
1α产生的副作用降到最低这一空白，有必要研发一种靶向促炎型巨噬细胞的工程化外泌体。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种靶向促炎型巨噬细胞的工程化外泌体；本专利技术的目的之二在于提供一种靶向促炎型巨噬细胞的工程化外泌体的制备方法；本专利技术的目的之三在于提供一种靶向促炎型巨噬细胞的工程化外泌体在对促炎型巨噬细胞活体示踪和显像以及制备炎症疾病治疗药物方面的应用。
[0005]为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：
[0006]1.一种靶向促炎型巨噬细胞的工程化外泌体，所述外泌体的膜外表面负载靶向肽，膜内表面负载标记蛋白。
[0007]优选的，所述外泌体来源于工具细胞、胚胎干细胞、围产期干细胞、成体干细胞或诱导性多能干细胞中的任意一种。
[0008]优选的，所述工具细胞选自HEK 293、Hela、NCI
‑
60、CHOs、C3H10T1/2、SW1353、
MC3T3
‑
E1、RAW264.7或C2C12中的任意一种；所述围产期干细胞选自脐带血、脐带、胎盘、间充质干细胞或亚全能干细胞中的任意一种；所述成体干细胞选自骨髓、脂肪、神经或皮肤中的任意一种。
[0009]优选的，所述靶向肽的氨基酸序列为FQHPSFI、SPLSQSA、LPSSGAA、TGSPELH、QMPEMKA、RQSHLKV、SGYPRHY、KYNTHHA、RGD或TKPR。
[0010]优选的，所述标记蛋白为绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白或蓝色荧光蛋白中的任意一种。
[0011]2.所述靶向促炎型巨噬细胞的工程化外泌体的制备方法，所述制备方法如下：
[0012]将编码重组蛋白的DNA序列插入PLVX
‑
puro慢病毒载体中，获得含有编码重组蛋白DNA序列的慢病毒，所述重组蛋白含有所述靶向肽和标记蛋白；然后感染分泌外泌体的细胞得到可分泌工程化外泌体的工程化细胞，收集所述工程化细胞进行培养，对培养后的工程化细胞培养上清进行过滤、离心，即可获得可靶向促炎型巨噬细胞的工程化外泌体。
[0013]优选的，所述重组蛋白包括信号肽、靶向肽、LAMP2B、标记蛋白和连接肽，信号肽、3个靶向肽、LAMP2B之间通过连接肽依次连接，LAMP2B的末端连接标记蛋白，所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，LAMP2B的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；标记蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
[0014]3.所述靶向促炎型巨噬细胞的工程化外泌体在对促炎型巨噬细胞活体示踪、显像以及制备炎症疾病治疗药物中的应用。
[0015]优选的，所述炎症疾病为关节炎。
[0016]优选的，所述炎症疾病治疗药物中包含装载HIF
‑
1α
‑
siRNA的工程化外泌体，所述HIF
‑
1α
‑
siRNA的序列为:AAACAGAGACGAAGGACAATT。
[0017]本专利技术的有益效果在于：本申请提供了一种靶向促炎型巨噬细胞的工程化外泌体。该外泌体的膜外表面负载靶向肽，膜内表面负载标记蛋白。当对其装载HIF
‑
1α
‑
siRNA可以靶向作用于关节炎性组织中的促炎型巨噬细胞，下调巨噬细胞的炎症反应，用于治疗膝关节炎症，滑膜肿胀和关节腔积液等病症，其治疗效果十分显著，非预知毒副作用小。同时，由于该外泌体中含有标记蛋白，因此其也可被用于实时显示其它如皮肤等炎症组织中活体炎性巨噬细胞的聚集情况。
[0018]本专利技术的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本专利技术的实践中得到教导。本专利技术的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。
附图说明
[0019]为了使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术作优选的详细描述，其中：
[0020]图1为含靶向肽和标记蛋白的重组蛋白结构示意图以及该靶向肽的DNA序列与氨基酸序列；
[0021]图2为PLVX
‑
puro慢病毒载体示意图；
[0022]图3为10种含靶向肽的重组慢性毒感染HEK 293T细胞的绿色荧光蛋白(eGFP)检测
图；
[0023]图4为靶向促炎型巨噬细胞的工程化外泌体的结构示意图以及其向促炎型巨噬细胞靶向递送治疗性siRNA下调巨噬细胞炎症反应的示意图；
[0024]图5为10种含靶向肽的不同工程化外泌体透射电镜和Nanosight检测结果；
[0025]图6为10种含靶向肽的不同工程化外泌体体外对促炎型巨噬细胞的靶向作用对比图；
[0026]图7为装载HIF
‑
...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种靶向促炎型巨噬细胞的工程化外泌体，其特征在于：所述外泌体的膜外表面负载靶向肽，膜内表面负载标记蛋白。2.根据权利要求1所述的一种靶向促炎型巨噬细胞的工程化外泌体，其特征在于：所述外泌体来源于工具细胞、胚胎干细胞、围产期干细胞、成体干细胞或诱导性多能干细胞中的任意一种。3.根据权利要求2所述的一种靶向促炎型巨噬细胞的工程化外泌体，其特征在于：所述工具细胞选自HEK 293、Hela、NCI
‑
60、CHOs、C3H10T1/2、SW1353、MC3T3
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E1、RAW264.7或C2C12中的任意一种；所述围产期干细胞选自脐带血、脐带、胎盘、间充质干细胞或亚全能干细胞中的任意一种；所述成体干细胞选自骨髓、脂肪、神经或皮肤中的任意一种。4.根据权利要求1所述的一种靶向促炎型巨噬细胞的工程化外泌体，其特征在于：所述靶向肽的氨基酸序列为FQHPSFI、SPLSQSA、LPSSGAA、TGSPELH、QMPEMKA、RQSHLKV、SGYPRHY、KYNTHHA、RGD或TKPR。5.根据权利要求1所述的一种靶向促炎型巨噬细胞的工程化外泌体，其特征在于：所述标记蛋白为绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白或蓝色荧光蛋白中的任意一种。6.权利要求1～5任一项所述的一种靶向促炎型巨噬细胞的工程化外泌体的制备方法，其特征在于：所述制备方法如下：将编码重组蛋白的DNA序列插...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈林，旷梁，李松，陈涵纲，倪振洪，谢杨丽，杜晓兰，朱莹，
申请(专利权)人：中国人民解放军陆军特色医学中心，
类型：发明
国别省市：