一种葡萄糖探针及其制备方法和利用这种葡萄糖探针的糖芯片及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种葡萄糖探针及其制备方法和利用这种探针的糖芯片及其制备方法。本发明专利技术以葡萄糖单糖为原料，依次通过全乙酰化、溴代、硝基化、氨基化和脱乙酰化得到１－对氨基苯氧基葡萄糖，即葡萄糖探针；在利用偶联剂将葡萄糖探针分子连接在固相载体上，形成糖芯片。本发明专利技术的葡萄糖探针将活性较高的伯氨基连接到葡萄糖的最活泼的异头碳上，具有较高的活性效率。将探针分子键接到固相载体上，在糖与固相载体之间可形成较长的一段间隔链，以避免载体和生物分子之间的空间位阻，而且该间隔链兼具苯环的刚性和氨基的柔性，即可自由移动又能固定在某一位置，较以往的糖芯片有较高的灵敏性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及糖芯片领域，更具体地讲，涉及一种葡萄糖探针及其制备方法和利用葡 萄糖探针的糖芯片。
技术介绍
糖结合蛋白具有重要的生物学功能，其表现在细胞间的通讯和识别，细胞与病原微 生物的相互作用，细胞内蛋白的运输，蛋白间的相互作用，蛋白与受体的特异性结合等 方面。生物芯片技术的三个探索方向即是基因芯片、蛋白质生物芯片及糖生物芯片。糖 生物芯片的优越性在于其一，生物活性稳定。糖生物芯片可在室温条件下长期保存生 物活性不变。其二，应用范围广泛。把糖生物芯片技术应用于医学临床上，可对多种传 染性与非传染性疾病同时进行快速诊断。因为所有的细胞表面都有含糖物质，这些糖化分子在细胞分子的识别过程中起着重要的作用。例如，血型的测定，人体免疫细胞对微 生物病原体和某些肿瘤的识别等。糖芯片作为近年来快速发展起来的一种生物技术，是在基因芯片和蛋白质芯片研究 基础上相应诞生的，其基本原理也与基因芯片和蛋白质芯片相似，即将多个不同结构的 糖分子通过共价或非共价作用固定于经化学修饰的基板上，进而对糖蛋白等待测样品或 糖分子本身进行测试、分析。而在糖芯片制备中，糖探针的合成和固定是最重要的一步。关于糖探针的制备方法，目前常见的方法根据化学作用的原理不同主要可分为三种Cu (I)催化的叠氮与炔烃的反应: Huang等用可编程一锅法合成了胸腺癌细胞和卵巢癌 细胞表面的六糖抗原Globo H以及多种去顶端衍生物后，再用叠氮基团活化这些寡糖。 然后在Cu (I)的催化下，炔基和叠氮基发生1, 3-偶极成环加成反应，从而将制得糖探 针。Diels-Alder成环加成反应: Sun等开发了连续使用Diels-Alder成环加成反应和Click反应的糖 探针合成工艺。马来酰亚胺与环戊二烯进行的Diels-Alder成环加成反应被用来作为糖探 针的合成反应。逆Michael加成反应: Park等报道了将玻璃片表面用巯基修饰后，通过逆Michael加成反应 将马来酰亚胺基团连接到单糖上制得糖探针分子。但在以上制备方法中，由于所值得的糖探针都存在反应基团活性不够的缺点，因此 对后面糖芯片制备过程中的糖探针和基板的偶联存在较大的不利影响，影响了糖芯片实 用性，所以在糖芯片的制备过程中糖探针的活性是急需考虑的一个问题，为此，科学家尝试了不同的合成方法来提高所合成糖探针的活性。同时采用物理吸附法制备糖芯片， 固定在固相载体上的还原糖在实验过程中易脱落，影响结果的准确性。
技术实现思路
本专利技术旨在克服常见糖探针合成方法中所存在的活性不够和作用力不强的问题，并 提高后续糖芯片的制备效率，提供一种葡萄糖探针及其制备方法和利用这种葡萄糖探针 的糖芯片及其制备方法。本专利技术的葡萄糖探针，分子为l一对氨基苯氧基葡萄糖，其中将伯氨基团通过苯氧基 键接到葡萄糖分子的异头碳上。本专利技术的制备葡萄糖探针方法，以葡萄糖单糖为原料，依次通过全乙酰化、溴代、 硝基化、氨基化和脱乙酰化得到葡萄糖探针1-对氨基苯氧基葡萄糖，按照下述步骤制备(1) 将20—25质量份葡萄糖、3 — 8质量份碘加入到1一5质量份醋酸酐中，形成悬浮 溶液，室温反应至体系呈棕色透明；(2) 采用二氯甲垸对歩骤(1)得到的反应体系进行稀释，然后在冰浴条件下，向 其中加入3 — 8质量份溴化氢的冰醋酸溶液，其中溴化氢的体积分数为40% — 50%，在室 温下反应l一6h，洗涤，过滤，重结晶，得到乙酰溴代葡萄糖；(3) 先将1一5质量份的四丁基溴化铵，溶剂氯仿和水放入反应容器中，再将过量的 对硝基苯酚和氢氧化钠加入反应容器中，然后加入20 — 30质量份乙酰溴代葡萄糖，搅拌， 反应温度为35—60'C，反应时间4一8h，分离出有机相，洗涤，过滤，干燥，得到l-对硝 基苯氧基-2,3,4,6-四-0-乙酰基葡萄糖；(4) 将5 —15质量份1-对硝基苯氧基-2,3，4,6-四-0-乙酰基葡萄糖溶于乙醇中，加入过 量铁粉，加热搅拌使其充分溶解，向体系中滴加1一5质量份盐酸，60—8(TC加热回流3 — 8h，抽滤，得到黑色的滤液，脱色，萃取，将得到的l-对氨基苯氧基-2,3，4,6-四乙酰化葡 萄糖，干燥；(5)将5 — 15质量份无水甲醇和5 — 15质量份无水甲醇共轭碱放入反应器中，再向 其中加入3 — 8质量份l-对氨基苯氧基-2,3,4,6-四乙酰化葡萄糖，室温反应20—24h，静置， 萃取，重结晶，得到l一对氨基苯氧基葡萄糖。本专利技术的利用葡萄糖探针的糖芯片，以马来酸酐接枝改性的聚苯乙烯为固相载体， 所述马来酸酐与偶联剂的氨基共价链接，所述偶联剂另一端的羟基与探针分子l一对氨基 苯氧基葡萄糖中异头碳上的氨基共价链接，以使探针分子l一对氨基苯氧基葡萄糖键接到 固相载体上。所述偶联剂为4-羟基苯甲酰肼或者4-羟基丁酰肼。 本专利技术的一种制备糖芯片的方法，按照下述步骤进行 (1)将偶联剂溶于有机溶剂中，配成1O — 50mol/L的溶液；(2) 将马来酸酐接枝改性的聚苯乙烯载体浸入上述溶液中，室温下孵育2 — 8h;(3) 将经过步骤(2)处理后的固相载体，用步骤(1)配成的有机溶液进行清洗；(4) 将清洗后的固相载体在室温下离心干燥，保存于千燥容器中，备用；(5) 将探针分子l一对氨基苯氧基葡萄糖用水溶解；(6) 向l一对氨基苯氧基葡萄糖的水溶液中加入pH3—6的酸性点样缓冲液，对固 相载体进行点样；(7) 点样后的固相载体于25—60。C，温育8 — 15h。 所述偶联剂为4-羟基苯甲酰肼或者4-羟基丁酰肼。所述步骤(1)中的有机溶剂为乙酸乙酯、乙酸甲酯、乙腈或二甲基甲酰胺。 所述步骤(5)中溶解探针分子l一对氨基苯氧基葡萄糖的水为超纯水、双蒸水、去 离子水或纯水。所述步骤(7)中的点样是指手工点样或者机器点样。本专利技术的技术方案以葡萄糖单糖为原料，依次通过全乙酰化、溴代、硝基化、氨基 化和脱乙酰化得到葡萄糖探针1-对氮基苯氧基葡萄糖，如附图1和2所示(附图1显示 的是探针分子的合成路线图；附图2的红外谱图说明制备过程中存在的中间产物，如1-溴代-2，3，4,6-四-0-乙酰基葡萄糖、l-对硝基苯氧基-2,3，4,6-四-0-乙酰基葡萄糖和1-对氨基 苯氧基-2,3,4，6-四-0-乙酰基葡萄糖)。本专利技术的葡萄糖探针将反应活性较高的伯氨基连 接到葡萄糖活性最高的异头碳上，可大大縮减的糖探针的合成过程和大范围的提高糖探 针的活性效率。本专利技术所构建的糖芯片的优点本专利技术采用荧光标记法来研究拌刀豆球 蛋白(ConA)和葡萄糖探针的相互作用，进而研究检测的灵敏性。结果表明本专利技术的糖 芯片较以往的糖芯片有较高的灵敏性。原因在于本专利技术所合成的糖探针，带有对氨基苯 基，和聚苯乙烯上的羧基偶联后，在糖与固相载体之间可形成较长的一段间隔链，以避 免载体和生物分子之间的空间位阻，而且该间隔链兼具苯环的刚性和氨基的柔性，即可 自由移动又能固定在某一位置，因此糖探针的活性较高。同时，聚苯乙烯固相载体表面 又较易进行化学修饰，利用有机化合物与糖之间形成的共价键,将糖分子固定于载体表面， 加强样品和载体表面的吸附,使得被固定的糖分子不易从玻片表面脱落。因此灵敏性较高。附图说明附图l探针分子l一对氨基苯氧基葡萄糖的合成流程图。附图2 l—对本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种葡萄糖探针，其特征在于，葡萄糖探针分子为１－对氨基苯氧基葡萄糖，其中将伯氨基团通过苯氧基键接到葡萄糖分子的异头碳上。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：侯信，黄河，贾红英，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]