一种提高重组蛋白表达效率的酸性表面助溶短肽标签制造技术

本发明专利技术为一种提高重组蛋白表达效率的酸性表面助溶短肽标签，涉及一种分离的肽，其包含氨基酸序列VDNKFNKEQQX1AFYEILH LPNLNEEQRNAFIQX2LKDDPX3X4SX5X6X7LX8EAX9X

【技术实现步骤摘要】
一种提高重组蛋白表达效率的酸性表面助溶短肽标签


[0001]本专利技术属于蛋白纯化领域，具体涉及了一种利用计算机辅助计算设计的酸性表面助溶短肽标签。

技术介绍

[0002]近年来随着生物技术的不断发展，重组蛋白表达和纯化技术一直受到人们的重视和广泛应用，其中原核表达成本最低，最易于操作和纯化效率最高。大肠杆菌(E.coli)是重组蛋白生产最常用的宿主生物之一。
[0003]很多富含疏水氨基酸残基的重组蛋白，尤其一些来自非原核生物的重组蛋白，由于原核细胞内部缺乏相应的蛋白折叠和保护机制，常常面临难溶解和大量进入包涵体的问题。这些在表达过程中发生沉淀的重组蛋白即便在重新溶解后也存在大量失活的现象。
[0004]为达到增加表达量，提高产物的正确构象比例及可溶性，方便下游纯化操作，人们采用助溶蛋白融合表达的方式，应用如绿色荧光蛋白(GFP)、麦芽糖结合蛋白(MBP)、谷胱甘肽硫转移酶(GST)等。然而，由于这些助溶蛋白自身分子量较大，仍然存在折叠时间较长，助溶效果有限和易干扰重组蛋白活性等缺陷。因此，本领域需要设计和开发新的助溶肽分子助力重组蛋白的生产纯化。

技术实现思路

[0005]由于大多数蛋白质具有偏酸性或中性的等电点[Link A J et al.，Comparing the predicted and observed properties of proteins encoded in the genome of Escherichia coli K
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12，ELECTROPHORESIS,1997,18(8):1259
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1313]，因此本专利技术通过计算机辅助计算，对短小的稳定蛋白结构域进行电荷分布的表面化设计，使之表面包含多个负电荷，使之本身极性提高更容易溶于水，并能够与具有偏酸性等电点的蛋白质发生互斥作用，可使蛋白纯化过程中减少聚集，不仅起到优越的助溶作用，也减少了对重组蛋白自身折叠过程的干扰。细菌的一些受体蛋白的溶剂暴露表面，特别是那些含有螺旋束结构的受体表面，被证明是非常稳定的[Alexander P et al.，Thermodynamic analysis of the folding of the streptococcal protein G IgG
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binding domains B1 and B2:why small proteins tend to have high denaturation temperatures，Biochemistry,1992.31(14):3597
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3603]。可以利用这些稳定的溶剂暴露表面区域的区域来设计稳定的助溶肽。
[0006]本专利技术的酸性表面助溶短肽标签(Sacid)基于葡萄球菌蛋白A的B结构域[N et al.，A synthetic IgG
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binding domain based on staphylococcal protein A，Protein Eng,1(2):107
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113，1987]改造而来。该结构域短小稳定，仅含57个氨基酸残基，分子量仅8kD，适合进行电荷分布改造和作为融合标签添加到重组蛋白上，其可高效助溶重组蛋白，在提纯过程中稳定重组蛋白构象，提高重组蛋白表达效率，维持其生物学功能活性。本专利技术将这种改造后的表面富含负电荷的短小多肽嫁接到目标重组蛋白，与早期其他研究
者已发表的正电荷助溶标签相比，对提高重组蛋白的表达效率、溶解性和生物活性方面更具优势。
[0007]在第一方面，本专利技术提供了一种分离的肽，其包含氨基酸序列VDNKFNKE QQX1AFYEILHLPNLNEEQRNAFIQX2LKDDPX3X4SX5X6X7LX8EAX9X
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LNDA QPK(SEQ ID NO：9)，其中：X1‑
X
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均是带负电荷氨基酸，优选为谷氨酸(E)或天冬氨酸(D)。
[0008]在第二方面，本专利技术提供了一种分离的多核苷酸，其编码第一方面的肽。
[0009]在第三方面，本专利技术提供了一种分离的融合蛋白，其包含第一肽和第二肽，其中所述第一肽是第一方面的肽，所述第二肽是目的多肽。
[0010]在第四方面，本专利技术提供了一种分离的多核苷酸，其编码第三方面的融合蛋白。
[0011]在第五方面，本专利技术提供了一种构建体，其包含第四方面的多核苷酸。
[0012]在第六方面，本专利技术提供了一种宿主细胞，其包含第四方面的多核苷酸或第五方面的构建体，其中所述宿主细胞能够表达所述融合蛋白。
[0013]在第七方面，本专利技术提供了一种生产融合蛋白的方法，包括：(a)在适合融合蛋白表达的条件下培养第六方面的宿主细胞；和(b)回收融合蛋白，任选地，(c)切割融合蛋白以释放目的多肽和(d)回收所述目的多肽。
[0014]在第八方面，本专利技术提供了第一方面的肽或第二方面的多核苷酸用于生产目的蛋白的用途。
[0015]在第九方面，本专利技术提供了一种生产目的蛋白的方法，包括：(a)在宿主细胞中表达目的蛋白与第一方面的肽融合形成的融合蛋白；(b)切割融合蛋白，释放目的蛋白；和(c)任选地，分离和/或纯化所述目的蛋白。
附图说明
[0016]图1：不同短肽标签的氨基酸序列的序列比对结果。其中，Wt相应于SEQ IDNO：4；Zbasic相应于SEQ ID NO：7；Sacid相应于SEQ ID NO：1；Sacid1相应于SEQ ID NO：2；以及Sacid2相应于SEQ ID NO：3。
[0017]图2：不同短肽标签在生理pH的静电势模型；A图为葡萄球菌蛋白A的B结构域在生理pH下N端(左)和C端(右)的静电势模型；B图为Zbasic在生理pH下N端(左)和C端(右)的静电势模型；C图为Sacid在生理pH下N端(左)和C端(右)的静电势模型；D图为Sacid 1在生理pH下N端(左)和C端(右)的静电势模型；E图为Sacid 2在生理pH下N端(左)和C端(右)的静电势模型。
[0018]图3：通过计算机辅助预测的溶解度及等电点(网址https://protein
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sol.manchester.ac.uk/)。其基于序列预测蛋白质可溶性。基于对无细胞表达的大肠杆菌蛋白质溶解度双峰分布的观察[Niwa T et al.，Bimodal protein solubility distribution revealed by an aggregation analysis of the entire ensemble of Escherichia coli proteins，Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America,2009,106(11):4201
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4206]，这本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分离的肽，其包含氨基酸序列VDNKFNKEQQX1AFYEILHLPNLNE EQRNAFIQX2LKDDPX3X4SX5X6X7LX8EAX9X
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LNDAQPK(SEQ ID NO：9)其中：X1‑
X
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均是带负电荷氨基酸，优选为E或D，优选地，所述肽的等电点pI等于或小于5.0。2.权利要求1的肽，其包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列或由SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列组成。3.一种分离的多核苷酸，其编码权利要求1或2的肽。4.一种分离的融合蛋白，其包含第一肽和第二肽，其中所述第一肽是权利要求1或2的肽，所述第二肽是目的多肽，任选所述第二肽通过间隔物连接于所述第一肽。5.权利要求4的融合蛋白，其中：所述间隔物包含切割位点，优选选自化学切割位点、酶法切割位点和自切割位点，和/或，所述融合蛋白还包含与所述第二肽连接的用于分离纯化的部分，例如6组氨酸标签、GST标签、Strep标签、Twin
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Strep标签或MBP标签，和/或，所述第二肽具有低于、等于或略大于7.0例如等于或低于8.0、7.0、6.5、6.0、5.5、5.0、4.5或4.0的酸性或中性或弱碱性等电点，更优选所述第二肽的长度为20
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500个氨基酸残基，例如包含SEQ ID NO：5所示氨基酸序列的NsiI蛋白或包含SEQ ID NO：8所示氨基酸序列的TEVP蛋白。6.一种分离的多核苷酸，其包含编码权利要求4或5的融合蛋白的核苷酸序列。7.一种构建体、优选表达构建体，其包含权利要求6的多核苷酸。8.一种宿主细胞，其包含权利要求6的多核苷酸或权利要求7的构建体优选表达构建体，其中所述宿主细胞能够表达所述融合蛋白，优选地，所述宿主细胞选自原核生物、酵母和真核细胞例如哺乳动物细胞或昆虫细胞，更优选选自埃希氏菌属(Escherichia)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙门氏菌属(Salmonella)、假单胞菌属(Pseudomonas)和链霉菌属(Streptomyces)，更优选选自埃希氏菌属，更优选是大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽抱杆菌(Bacillus subtilis)或巨大芽抱杆菌(Bacillus megaterium)，更优选大肠杆菌Rosetta(DE3)。9.一种生产权利要求4或5的融合蛋白的方法，包括：(a)在适合融合蛋白表达的条件下培养权利要求8的宿主细胞；和(b)回收融合蛋白，任选地，(c)切割融合蛋白，释放目的多肽；和(d)回收所...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵晟，李鹏，孙秀莲，仲明，王志民，
申请(专利权)人：济南宜明医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：