腺相关病毒易感性细胞株及其应用制造技术

本文提供了一种腺相关病毒易感性细胞株及其应用，具体地，本文提供了一种腺相关病毒易感性细胞株，还提供了该细胞株的应用。该细胞株为保藏号CCTCC NO：C202331的人肾上皮细胞293T

【技术实现步骤摘要】
腺相关病毒易感性细胞株及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及以HEK293T细胞为基础稳定表达腺病毒(Ad5)的三段基因：E4基因(Orf6)、E2A基因及VARNA基因的人肾上皮细胞293T
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AH10细胞株。本专利技术还涉及该细胞株在测定AAV感染滴度的应用。

技术介绍

[0002]随着生物工程技术在科研、食品、化工、医疗等诸多领域的推广，各种基于DNA的基因载体被广泛使用，以病毒作为DNA递送载体的方法被广泛应用。其中AAV(腺相关病毒)，是一类单链线状DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒(腺病毒或疱疹病毒)同时感染才能在体内复制。其优点在于安全性高(目前还未有AAV对人类致病的报道)，免疫原性低，感染谱广，表达时间长，扩散性强，稳定性高等特点。因此rAAV(重组AAV)适合作为治疗基因相关临床疾病的DNA载体。
[0003]rAAV滴度的测定在科学研究、临床研究和生物工程制药领域，特别是细胞基因治疗(CGT)领域是非常重要的载体质量评估指标之一，其准确性对上述AAV相关应用实践的意义非凡。目前在生产中主要的测定方式为通过qPCR直接测定rAAV的基因组滴度(Viral genome，Vg)，该方法的缺点是不能体现AAV病毒样品的活力和感染细胞的实际能力，只能由样品中的DNA拷贝数推测病毒颗粒数；为了更准确反映rAAV的活力及其感染细胞的实际能力，需要测定rAAV的感染滴度(Infectious titer)。AAV感染不产生细胞病变，因此不能通过蚀斑实验测定其感染滴度，但是在腺病毒(Ad)辅助蛋白共同参与的情况下，可以诱导AAV在细胞内复制并表达病毒基因组中的基因，从而可以通过检测复制的病毒基因组或报告基因的表达情况检测到被感染的细胞，然后根据梯度稀释的比例推算原AAV病毒的感染滴度。
[0004]目前存在几种较常用的感染滴度测定方法包括：测定AAV的半数感染量(TCID
50
)；该方法用梯度稀释的AAV2和一定浓度的腺病毒(Ad)共感染已有AAV2 rep和cap基因稳定表达的Hela细胞系，等AAV2在细胞内复制一定时间后再用qPCR方法检测新复制的AAV2的基因组序列的拷贝数，再由此推测出原AAV2病毒感染滴度。另一种方法是ICA(infectious center assay)；其检测方法与上一种相似，依然是用Ad5辅助梯度稀释的AAV2，共感染已有AAV2 rep和cap基因稳定表达的Hela细胞系，再将细胞接种到包被杂交探针了的尼龙膜上，从而通过分析膜上的阳性细胞数推算出病毒的感染滴度。除此之外，也可以通过检测被感染细胞表达病毒携带的报告基因的强度来测定感染滴度。该方法通常是将纯化后的病毒梯度稀释后，感染一定数量的易感细胞，通过计算表达报告基因的阳性细胞数和稀释比例来推算病毒的感染滴度。该方法在用于检测AAV的感染滴度时，为了提高AAV的易感性，常常也会使用腺病毒共感染来获得辅助基因的表达。
[0005]总之，这些常规方法检测rAAV感染滴度时，通常需要辅助病毒如腺病毒的存在，引入和制备其他病毒检测不仅涉及另一种病毒的添加产生材料的浪费，测试所需时间长(一般需要一周以上)，而且腺病毒感染会导致细胞病变，毒性较大，测试细胞会出现大量死亡，影响数据统计。同时，共感染多种病毒也会带来不同测试批次之间的数据不稳定性。而且，
对需要使用稳定表达AAV2 rep和cap的细胞株的测试方案来说，由于Rep和Cap蛋白对细胞具有一定毒性，也会影响滴度的测试，需要设计适度表达这些蛋白才能获得可持续使用的稳定细胞株。因此，本领域亟需设计新的无辅助病毒参与的用于检测各AAV血清型感染滴度的细胞。

技术实现思路

[0006]在一方面，本文提供了保藏号为CCTCC NO：C202331的人肾上皮细胞293T
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AH10细胞。
[0007]本文的细胞株人肾上皮细胞293T
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AH10保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉大学，保藏日期：2023年2月7日，保藏编号：CCTCCNO：C202331。
[0008]另一方面，本文提供了上述人肾上皮细胞293T
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AH10细胞在检测腺相关病毒的病毒滴度中的应用。
[0009]在一些实施方案中，所述腺相关病毒可选自各类血清型AAV，如常见的AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或其他特殊血清型AAV。
[0010]在一些实施方案中，所述腺相关病毒为重组腺相关病毒。
[0011]另一方面，本文提供了检测腺相关病毒的病毒滴度的试剂盒，其包括上述人肾上皮细胞293T
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AH10细胞。
[0012]另一方面，本文提供了所述腺相关病毒可选自各类血清型AAV，如常见的AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9或其他特殊血清型AAV。
[0013]另一方面，本文提供了所述腺相关病毒为重组腺相关病毒。
[0014]本文提供的人肾上皮细胞293T
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AH10细胞株可适度的稳定表达腺病毒(Ad5)的三段基因：E4基因(Orf6)、E2A基因及VARNA基因。与HEK293或HEK293T细胞相比，其可以提高rAAV感染细胞后目的基因的表达，可以在无辅助病毒的情况下，增加测定AAV感染滴度的灵敏度和精确度。
附图说明
[0015]图1：包含目的基因质粒的pHelper质粒图谱。
[0016]图2：人肾上皮细胞293T
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AH10与HEK293T感染rAAV
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GL后荧光显微镜下拍摄结果。人肾上皮细胞293T
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AH10与HEK293T感染相同数量MOI(1E+05)不同血清型rAAV
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GL(如血清型8和9)，293T
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AH10表达的荧光强度均显著高于HEK293T细胞。
[0017]图3：用人肾上皮细胞293T
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AH10及HEK293细胞检测rAAV
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GL(如血清型8)的感染检出敏感度。人肾上皮细胞293T
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AH10的检出的敏感度(与无病毒空白对照差异显著)是HEK293细胞的16倍以上。
[0018]图4：用人肾上皮细胞293T
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AH10及HEK293T细胞检测rAAV
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GL(如血清型8)的感染检出敏感度。人肾上皮细胞293T
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AH10的检出的敏感度(与无病毒空白对照差异显著)是HEK293T细胞的4倍以上。
具体实施方式
[0019]除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常
理解的含义。
[0020]本专利技术中未作具体说明的实验方法，均按照相关产品说明书进行。本专利技术中所用生物试剂，无特殊说明，均可以从商业途径获得。本领域技术人员本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.保藏号为CCTCC NO：C202331的人肾上皮细胞293T
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AH10细胞。2.权利要求1所述的人肾上皮细胞293T
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AH10细胞在检测腺相关病毒的病毒滴度中的应用。3.如权利要求2所述的应用，其中所述人肾上皮细胞293T
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AH10细胞中，通过使用低启动活性的启动子(mimmal CMV)稳定地适度表达腺病毒(Ad5)的三段基因：E4基因(Orf6)、E2A基因及VARNA基因，降低了所述三段基因的表达产物对所述人肾上皮细胞293T
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AH10细胞的毒性，从而筛选获得稳定细胞株。4.如权利要求2所述的应用，其中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙秀莲，赵晟，郭典，朴顺福，陈瑶，王志民，仲明，张华，
申请(专利权)人：济南宜明医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：