一种小鼠小肠类器官的培养基及培养方法技术

本发明专利技术涉及类器官培养技术，具体而言，涉及一种小鼠小肠类器官的培养基及培养方法。该培养基包括：基础培养基、特异性添加因子、Wnt通路激活剂TWS119和BMP I型受体抑制剂LDN

【技术实现步骤摘要】
一种小鼠小肠类器官的培养基及培养方法


[0001]本专利技术涉及类器官培养技术，具体而言，涉及一种小鼠小肠类器官的培养基及培养方法。

技术介绍

[0002]长期以来，肠道上皮细胞被认为是代谢和免疫形态的重要调节因子，但是肠道的体外研究一直存在困难。目前尚缺乏理想的肠上皮体外研究模型。
[0003]细胞系及原代细胞/组织的培养均无法反映肠道的多样性和复杂性，两种方法均有诸多缺陷。而体外构建的肠道类器官提供了一个生理相关的细胞模型，包含所有类型的肠上皮细胞，并具有水、离子吸收和转运等生理功能，这些优势是单一细胞系所无法比拟的，基于3D类器官进行肠道上皮细胞生物学功能和肠道疾病建模的研究可缩短研究周期，减少实验动物的使用。
[0004]然而，在现有技术中，小鼠小肠类器官培养条件尚未统一，小鼠小肠类器官在培养过程中尤其是原代的通常不宜培养成功且生长十分缓慢。而常规添加的生长因子，如WNT 3a，价格昂贵，并且这样的生长因子在不同批次之间的效果不一致，导致对小鼠小肠类器官的培养效果差异巨大，稳定性较差。
[0005]另外，在常规的培养步骤中，往往采用EDTA消化的方式分离小鼠小肠绒毛和隐窝，这样分离获得的细胞有限，进一步限制了培养的效率。

技术实现思路

[0006]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种小鼠小肠类器官的培养基及培养方法。
[0007]本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：
[0008]本专利技术提供一种小鼠小肠类器官的培养基，所述培养基包括：基础培养基、特异性添加因子、Wnt通路激活剂TWS119和BMP I型受体抑制剂LDN
‑
193189。
[0009]进一步，所述Wnt通路激活剂TWS119在所述培养基中的浓度为10
‑
15nmol/L。
[0010]进一步，所述BMP I型受体抑制剂LDN
‑
193189在所述培养基中的浓度为2
‑
5nmol/L。
[0011]进一步，所述基础培养基为Advanced DMEM/F12；所述特异性添加因子包括Glutamax添加剂、HEPES缓冲液、N
‑
乙酰半胱氨酸、青链霉素、B27、R
‑
spondin1重组蛋白、Noggin蛋白以及EGF。
[0012]进一步，所述培养基中，Glutamax添加剂的浓度为1
×
、HEPES缓冲液的浓度为1
×
、N
‑
乙酰半胱氨酸的浓度为0.75
‑
1.25mmol/L、青链霉素的浓度为1
×
、B27的浓度为1
×
、R
‑
spondin1重组蛋白的浓度为300
‑
500ng/mL、Noggin蛋白的浓度为80
‑
100ng/mL、EGF的浓度为30
‑
50ng/mL；溶剂为所述Advanced DMEM/F12基础培养基。
[0013]本专利技术还提供一种小鼠小肠类器官的培养方法，采用如上述的培养基进行培养。
[0014]进一步，包括以下步骤：
[0015]S1、获取待培养的小鼠小肠样本，并进行前处理，得到肠段；对所述肠段进行挤压，使肠段中的绒毛和隐窝分离并获取脱落的组织；收集所述脱落的组织，并制备得到小鼠小肠细胞沉淀；
[0016]S2、采用所述小鼠小肠类器官的培养基对所述小鼠小肠细胞沉淀进行重悬，再加入基质胶混合均匀，得到小鼠小肠细胞悬液；
[0017]S3、对所述小鼠小肠细胞悬液进行滴胶接种，接种后在温度为37℃、充满CO2环境下静置至胶滴充分凝固；再向每个胶滴上加入所述小鼠小肠类器官的培养基，继续在37℃、体积百分数为5％的CO2的条件下培养；
[0018]S4、观察培养结果，当培养得到小鼠小肠类器官的直径为80～120μm时，完成培养。
[0019]进一步，所述步骤S1中，所述前处理的过程为：
[0020]取小鼠的胃下小肠作为所述待培养的小鼠小肠样本，清理其中的食糜，再清洗、剪切；之后，依次采用MasterAim小鼠小肠裂解液和冰DPBS进行处理，处理后得到所述肠段；
[0021]所述制备所述小鼠小肠细胞沉淀的过程为：
[0022]将所述脱落的组织放置在温度为0～4℃的DPBS溶液中，得到细胞悬液；对细胞悬液进行过滤，收集滤出液，并在室温在以1300rpm的速度离心3min，弃上清后，得到所述小鼠小肠细胞沉淀。
[0023]进一步，所述步骤S2中，所述基质胶与所述小鼠小肠类器官的培养基的体积比为1.5～2：1；所述基质胶为未经稀释的基质胶。
[0024]进一步，所述步骤S3中，进行滴胶接种时，每个所述胶滴的体积为50μL；每个所述胶滴上加入500μL室温的所述小鼠小肠类器官的培养基。
[0025]本专利技术的有益效果为：
[0026](1)本专利技术的小鼠小肠类器官的培养基，添加了Wnt通路激活剂TWS119和BMP I型受体抑制剂LDN
‑
193189，这两种成分能够相互配合起到协同作用，促进小鼠小肠隐窝的未分化状态下的细胞干性维持生长和快速增殖；
[0027](2)本专利技术的小鼠小肠类器官的培养基，采用的Wnt通路激活剂TWS119和BMP I型受体抑制剂LDN
‑
1931892均为低分子量化合物，具有成本低、一致性高的优点；这两种小分子可以通过调节信号转导途径、基因表达或代谢来控制细胞的生长过程，对小鼠小肠的形成及其干性的维持效果显著；
[0028](3)本专利技术的小鼠小肠类器官的培养方法，采用挤压法使得小肠绒毛在变形区能获得比常规EDTA消化更为强烈和均匀的两向压缩状态，这样可以充分将绒毛及隐窝分离开来，从而获得大量的细胞，提高小鼠小肠类器官样本的成功率；
[0029](4)本专利技术的小鼠小肠类器官的培养方法，具有构建时间短、构建效率高、成功率高的优点，能够进行产业化推广。
附图说明
[0030]图1为本专利技术的小鼠小肠类器官的培养基，实施例1和对比例1～3得到的小鼠小肠类器官的培养情况图，放大倍数为4倍；其中，图1中a～c为实施例1在培养的第0天、第2天和第4天的培养情况图，图1中d～f为对比例1在培养的第0天、第2天和第4天的培养情况图，图1中g～i为对比例2在培养的第0天、第2天和第4天的培养情况图，图1中j～l为对比例3在培
养的第0天、第2天和第4天的培养情况图；
[0031]图2为本专利技术的小鼠小肠类器官的培养基，实施例1和对比例1～3在培养第4天时的类器官个数对比图。
具体实施方式
[0032]以下结合附图对本专利技术的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。
[0033]本专利技术的小鼠小肠类器官的培养基，包括：基础培养基、特异性添加因子、Wnt通本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种小鼠小肠类器官的培养基，其特征在于，所述培养基包括：基础培养基、特异性添加因子、Wnt通路激活剂TWS119和BMP I型受体抑制剂LDN
‑
193189。2.根据权利要求1所述一种小鼠小肠类器官的培养基，其特征在于，所述Wnt通路激活剂TWS119在所述培养基中的浓度为10
‑
15nmol/L。3.根据权利要求2所述一种小鼠小肠类器官的培养基，其特征在于，所述BMP I型受体抑制剂LDN
‑
193189在所述培养基中的浓度为2
‑
5nmol/L。4.根据权利要求3所述一种小鼠小肠类器官的培养基，其特征在于，所述基础培养基为Advanced DMEM/F12；所述特异性添加因子包括Glutamax添加剂、HEPES缓冲液、N
‑
乙酰半胱氨酸、青链霉素、B27、R
‑
spondin1重组蛋白、Noggin蛋白以及EGF。5.根据权利要求4所述一种小鼠小肠类器官的培养基，其特征在于，所述培养基中，Glutamax添加剂的浓度为1
×
、HEPES缓冲液的浓度为1
×
、N
‑
乙酰半胱氨酸的浓度为0.75
‑
1.25mmol/L、青链霉素的浓度为1
×
、B27的浓度为1
×
、R
‑
spondin1重组蛋白的浓度为300
‑
500ng/mL、Noggin蛋白的浓度为80
‑
100ng/mL、EGF的浓度为30
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50ng/mL；溶剂为所述Advanced DMEM/F12基础培养基。6...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢华杨，刘蕊，游明亮，蔡超杰，
申请(专利权)人：杭州艾名医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：