一种用于构建膀胱癌类器官的培养基及其培养方法技术

本发明专利技术公开了一种用于构建膀胱癌类器官的培养基及其培养方法。其包括基础培养基和添加因子；添加因子包括以下终浓度的组分：Mersalyl 0.25~1μg/mL、SY

【技术实现步骤摘要】
10mM、ALK5抑制剂 0.5μM、N
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FERULOYLOCTOPAMINE 4μM、N
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Acetylcysteine 1.25mM、Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B 100IU/mL、Wnt 3A 200ng/mL、R
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Spondin
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1 250ng/mL、Noggin 150ng/mL、FGF
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7 25ng/mL、FGF
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10 10ng/mL、FGF
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2 12.5ng/mL、BETACELLULIN 30ng/mL以及B27 0.5x。
[0007]进一步地，ALK5抑制剂为A83
‑
01。
[0008]进一步地，基础培养基为Advanced DMEM/F12。
[0009]一种用于构建膀胱癌类器官的培养基的制备方法，包括以下步骤：将上述添加因子加入至基础培养基中混合均匀即可。
[0010]一种膀胱癌类器官的培养方法，包括以下步骤：（1）对膀胱癌患者尿液进行处理，然后收集肿瘤细胞；（2）将步骤（1）收集的肿瘤细胞与基质胶混合重悬，然后接种，再静置至凝固，然后加入预热后的上述培养基进行培养即可。
[0011]进一步地，步骤（1）中对膀胱癌患者尿液进行处理的过程如下：（1）于1000~1200rpm条件下对收集的膀胱癌患者尿液离心10~15min，收集细胞沉淀；（2）将细胞沉淀放入离心管中，使用DPBS
‑r/>PS进行清洗，反复涮洗至清洗液澄清即可；（3）再加入DPBS
‑
PS对细胞进行重悬，然后过100~200μM的细胞筛网，并于1000~1500rpm条件下离心5~10min后，收集细胞。
[0012]进一步地，步骤（2）中接种量为50μL/滴，培养基的预热温度为37℃。
[0013]进一步地，在加入预热后的上述培养基后，每2
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4天更换一次培养基，培养7
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14天后进行传代培养。
[0014]进一步地，在步骤（1）收集细胞后，如若样本中含有较多红细胞（细胞沉淀呈现红色），则需加入1
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2 mL红细胞裂解液进行裂红，具体过程为：使用1 mL的枪头上下吹打几次，冰上孵育10min，若细胞沉淀体积小于100 μL，使用1 mL红细胞裂解液，若大于100 μL，需使用2 mL红细胞裂解液，然后于1500 rpm，离心5 min，收集细胞。
[0015]进一步地，步骤（2）中在37℃环境下静置凝固。
[0016]一种膀胱癌类器官，采用上述方法培养得到。
[0017]上述膀胱癌类器官在药物筛选中的应用。
[0018]本专利技术的有益效果：1、本专利技术对于肿瘤患者身体无创伤，并且可重复性强，可以提高膀胱癌类器官的增殖速度和膀胱癌类器官培养的成功率。
[0019]2、本专利技术有利于临床普遍开展膀胱癌肿瘤筛查以及治疗，有利于节省医疗资源和患者治疗成本，有助于改善患者的预后生活质量以及心理健康水平。
[0020]3、本专利技术是专门用于膀胱癌类器官培养的培养基，能够有效的建立膀胱癌类器官以及对其长期的维持培养和扩增，实现膀胱癌类器官的快速稳定生长。
[0021]4、本专利技术在培养基中添加了Marsalyl，Mersalyl作为一种缺氧诱导因子1（HIF
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1）诱导剂，能够显著诱导ENO1 mRNA的表达。与此同时，在培养基设计过程中，发现如果在培养基中再加入PI3K/AKT通路激动剂SY
‑
LB
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35，其能够与Marsalyl一同显著促进膀胱癌类器官
的生长与增殖，并且，根据实验可以确定，两者具有良好的协同增效作用。
附图说明
[0022]图1为本专利技术实施例1的人膀胱癌类器官培养图一；图2为本专利技术实施例1的人膀胱癌类器官培养图二；图3为本专利技术实施例2的人膀胱癌类器官培养图一；图4为本专利技术实施例2的人膀胱癌类器官培养图二；图5为本专利技术实施例3的人膀胱癌类器官培养图一；图6为本专利技术实施例3的人膀胱癌类器官培养图二；图7为本专利技术对比例1的人膀胱癌类器官培养图一；图8为本专利技术对比例1的人膀胱癌类器官培养图二；图9为本专利技术对比例2的人膀胱癌类器官培养图一；图10为本专利技术对比例2的人膀胱癌类器官培养图二；图11为本专利技术对比例3的人膀胱癌类器官培养图一；图12为本专利技术对比例3的人膀胱癌类器官培养图二；图13为本专利技术对比例4的人膀胱癌类器官培养图一；图14为本专利技术对比例4的人膀胱癌类器官培养图二；图15为本专利技术对比例5的人膀胱癌类器官培养图一；图16为本专利技术对比例5的人膀胱癌类器官培养图二；图17为本专利技术对比例6的人膀胱癌类器官培养图一；图18为本专利技术对比例6的人膀胱癌类器官培养图二。
具体实施方式
[0023]下面对本专利技术的具体实施方式进行描述，以便于本
的技术人员理解本专利技术，但应该清楚，本专利技术不限于具体实施方式的范围，对本
的普通技术人员来讲，只要各种变化在所附的权利要求限定和确定的本专利技术的精神和范围内，这些变化是显而易见的，一切利用本专利技术构思的专利技术创造均在保护之列。
[0024]实施例1本实施例提供一种构建膀胱癌类器官的培养基及其培养方法，该培养基成分和各组分浓度如下表1所示：表1 培养基成分和各组分浓度
采用上述培养基培养膀胱癌类器官的具体过程如下：（1）收集膀胱癌患者尿液，于1200rpm离心10min，收集细胞沉淀。
[0025]（2）将细胞沉淀收集放入15mL离心管中，使用DPBS
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PS（含1%三抗的DPBS）进行清洗，反复涮洗至清洗液澄清，约5
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10次。
[0026]（3）加入2 mL DPBS
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PS对细胞进行重悬，过100 μM的细胞筛网，1500rpm，离心5min，收集细胞。
[0027]（4）小心地倒出并丢弃上清液，避免接触到细胞沉淀。
[0028]（5）当样本含有较多的红细胞（细胞沉淀呈现红色）时，加入1
‑
2 mL红细胞裂解液进行裂红。首先使用1 mL的枪头上下吹打几次，冰上孵育10min，细胞沉淀体积小于100 μL，再使用1 mL红细胞裂解液，若大于100 μL，则需使用2 mL红细胞裂解液，然后于1500 rpm，离心5 min，收集细胞。
[0029]（6）将获取的细胞沉淀细胞计数后重悬于基质胶中，以50μL/滴进行接种，接种完成后，将培养板在37℃下静置30分钟以待基质胶完全凝固。
[0030]（7）使用移液枪沿着孔侧壁向每个孔中轻轻地加入500 μL于37℃预热的膀胱癌类器官培养基，再使用DPBS
‑
PS进行封边处理。
[0031]（8）每3天更换一次培养基，根据实际情况，培养至7
‑
14天时进行传本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于构建膀胱癌类器官的培养基，其特征在于，包括基础培养基和添加因子；所述添加因子包括以下终浓度的组分：Mersalyl 0.25~1μg/mL、SY
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LB
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35 1~5μg/mL、GlutaMax 1x、HEPES 10mM、Nicotinamide 10mM、ALK5抑制剂 0.25~1μM、N
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FERULOYLOCTOPAMINE 1~5μM、N
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Acetylcysteine 1.25mM、Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B 100 IU/mL、Wnt 3A 150~300ng/mL、R
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Spondin
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1 200~300ng/mL、Noggin 100~200ng/mL、FGF
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7 20~30ng/mL、FGF
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10 7.5~12.5ng/mL、FGF
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2 10~15ng/mL、BETACELLULIN 30~50ng/mL以及B27 0.5~1x。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述添加因子包括以下终浓度的组分：Mersalyl 0.5μg/mL、SY
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LB
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35 2μg/mL、GlutaMax 1x、HEPES 10mM、Nicotinamide 10mM、ALK5抑制剂 0.5μM、N
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FERULOYLOCTOPAMINE 4μM、N
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Acetylcysteine 1.25mM、Penicillin/Streptomycin/Amphotericin B 100IU/mL、Wnt 3A 200ng/mL、R
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【专利技术属性】
技术研发人员：游明亮，邢华杨，李静，谢素瑶，
申请(专利权)人：杭州艾名医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：