一种用于胸水来源类器官的培养基及培养方法技术

本发明专利技术公开了一种用于胸水来源类器官的培养基及培养方法，培养方法包括：制备胸水上清冻干粉，将其制成胸水上清冻干粉溶液，对培养器皿中进行包被，将胸水离心后的沉淀重悬后加入包被后的培养器皿中进行培养，培养结束后离心，得沉淀，将沉淀重悬后和基质胶混合，凝固，最后加入含胸水上清冻干粉的培养基进行培养。本发明专利技术通过在培养过程中加入胸水上清冻干粉，使类器官生长状态得到改善，提高了胸水来源类器官的成功率，较好的模拟类器官体内生存环境。环境。环境。

【技术实现步骤摘要】
一种用于胸水来源类器官的培养基及培养方法


[0001]本专利技术涉及类器官培养
，具体涉及一种用于胸水来源类器官的培养基及培养方法。

技术介绍

[0002]近年来，随着干细胞技术的发展，Hans Clever等建立了一种体外3D培养干细胞获得组织类器官的方法。类器官是指将具有干细胞潜能的细胞进行3D培养，从而形成相应器官的类似组织，并具有自我更新和自我组织的能力，维持了其来源组织的部分生理结构和功能的特点。过去的几十年，肿瘤研究的主要模型仍然是2D肿瘤细胞系，但肿瘤细胞系并不具有肿瘤细胞的异质性和肿瘤细胞在体内的特征，且在实验室的长期传代下，发生了基因组学的变异，无法反应对应肿瘤的真实情况；另外一种重要模型是人体肿瘤组织小鼠移植模型（PDX），虽然PDX模型能够很大程度地维持肿瘤的异质性，而且目前已经应用于肿瘤的药物测试和筛选，但是该模型仍然面临着包括移植成功率低、肿瘤样本量大和实验周期较长在内的诸多问题。与之相比，肿瘤类器官模型不仅在体外培养条件下能够无限增殖，很好地保持了肿瘤异质性，适用于大规模的药物筛选。
[0003]目前类器官培养主要集中在肿瘤手术/穿刺样本，胸水来源的类器官报道较少，而胸水样本获取在临床上较手术/穿刺样本更容易，为更有利于获取构建肿瘤类器官的样本来源。有文献报道利用微孔芯片去除胸水标本中的成纤维细胞，并在培养基中添加胸水上清扩增胸水来源类器官的方法，该方法可提高胸水来源类器官的成功率，但该方法要求微孔芯片的孔径为7
‑
20μm，技术要求高，成本高，不适合规模化应用，且该孔板只能保留富集大尺寸的肿瘤细胞或细胞团，类器官损失较多。胸水上清的保存时间较短，不易保存，只能用于自身来源的标本类器官的培养，不具有通用性。此外，也有向普通体外培养基中加入部分细胞因子，但是这样不能很好的体现体内环境，影响检测数据的准确性和真实性，且普通培养基体外培养的成功率低，培养周期相对较长，增加了培养成本，延后了后续的药敏实验进程。总之，成本高、培养成功率低、耗时长，仍是目前胸水来源类器官用于体外抗肿瘤药物评价临床实用性低的重要原因。

技术实现思路

[0004]为了解决现有技术存在的上述不足，本专利技术的目的是提供一种用于胸水来源类器官的培养基及培养方法，以解决现有成本高、培养成功率低、耗时长的问题。
[0005]本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种用于胸水来源类器官的培养基，包括：胸水上清冻干粉、基础培养基和添加剂；添加剂包括以下终浓度的组分：人重组蛋白R
‑
Spondin 1，20
‑
40ng/mL；头蛋白，80
‑
120ng/mL；人重组蛋白rhEGF，6
‑
10ng/mL；4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸，0.8
‑
1.2mM；L
‑
丙氨酰
‑
L
‑
谷氨酰胺，1
×
；青链双抗，1
×
；N2添加剂，1
×
；B27添加剂，1
×
；N
‑
乙酰
‑
L
‑
半胱氨酸，0.08
‑
0.1mM；Alk抑制剂A83
‑
01，0.3
‑
0.6μM；4
‑
(4
‑
氟苯基)
‑2‑
(4
‑
羟基苯基)
‑5‑
(4
‑
吡啶基)
‑
1H
‑
咪唑，0.2
‑
0.4μM；烟酰胺，3
‑
6mM。
[0006]本专利技术的有益效果为：胸水中含有大量的成纤维细胞和肿瘤细胞，在构建肿瘤细胞类器官的过程中，成纤维细胞和肿瘤细胞同时混杂生长，并且成纤维细胞通常比肿瘤细胞生长的更快，并且能抑制肿瘤细胞的生长，进而培养的肿瘤细胞类器官生长速度较慢，产量较低。
[0007]将胸水上清冻干制成冻干粉，首先，制备后的胸水上清冻干粉可随用随取，保存时间长，批次稳定，能定量，可用于不同的样品类器官的培养，且不用使用额外的耗材，大大节约了成本；其次，胸水中含有促细胞附着物质如层粘连蛋白、纤维连接蛋白、Ⅲ型胶原、血清扩展因子等，在培养基中加入了胸水上清冻干粉后，可促进成纤维细胞的贴壁，利于成纤维细胞和类器官的分离，达到去除成纤维细胞的目的；最后，培养基中的胸水上清冻干粉、基础培养基和添加剂能够共同促进类器官的生长，去除杂质，提高肿瘤细胞占比，进而有效的提高胸水来源肿瘤类器官的构建效率和成功率。
[0008]基础培养基为常用基础培养基，如Advanced DMEM/F
‑
12培养基。
[0009]进一步地，胸水上清冻干粉在培养基中的浓度为100
‑
200μg/mL。
[0010]进一步地，胸水上清冻干粉在培养基中的浓度为200μg/mL。
[0011]进一步地，添加剂包括以下终浓度的组分：人重组蛋白R
‑
Spondin 1，30ng/mL；头蛋白，100ng/mL；人重组蛋白rhEGF，8ng/mL；4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸，1mM；L
‑
丙氨酰
‑
L
‑
谷氨酰胺，1
×
；青链双抗，1
×
；N2添加剂，1
×
；B27添加剂，1
×
；N
‑
乙酰
‑
L
‑
半胱氨酸，0.09mM；Alk抑制剂A83
‑
01，0.5μM；4
‑
(4
‑
氟苯基)
‑2‑
(4
‑
羟基苯基)
‑5‑
(4
‑
吡啶基)
‑
1H
‑
咪唑，0.3μM；烟酰胺，5mM。
[0012]采用上述培养基培养胸水来源类器官的方法，包括以下步骤：（1）收取癌性胸水，离心，将胸水上清制成冻干粉，将沉淀清洗；（2）将胸水上清冻干粉溶解，制成胸水上清冻干粉溶液，然后加入培养器皿中进行包被，包被结束后吸出胸水上清冻干粉溶液；（3）将步骤（1）中的沉淀重悬后加入包被后的培养器皿中进行培养，培养结束后将未贴壁溶液离心，得沉淀；（4）将步骤（3）中的沉淀重悬，然后和基质胶混合，凝固，最后加入上述培养基进行培养。
[0013]本专利技术的有益效果为：将癌性胸水离心，上清液制成胸水上清冻干粉，沉淀为细胞沉淀。胸水上清冻干粉保存时间长，在使用时，需将胸水上清冻干粉溶解形成胸水上清冻干粉溶液，用胸水上清冻干粉溶液对培养器皿包被后，可更快更好地促进成纤维细胞的贴壁，因类器官体积较大，贴壁慢，这样操作，可使得成纤维细胞先贴壁，而此时类器官还未贴壁，这样吸取未贴壁的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于胸水来源类器官的培养基，其特征在于，包括：胸水上清冻干粉、基础培养基和添加剂；添加剂包括以下终浓度的组分：人重组蛋白R
‑
Spondin 1，20
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40ng/mL；头蛋白，80
‑
120ng/mL；人重组蛋白rhEGF，6
‑
10ng/mL；4
‑
羟乙基哌嗪乙磺酸，0.8
‑
1.2mM；L
‑
丙氨酰
‑
L
‑
谷氨酰胺，1
×
；青链双抗，1
×
；N2添加剂，1
×
；B27添加剂，1
×
；N
‑
乙酰
‑
L
‑
半胱氨酸，0.08
‑
0.1mM；Alk抑制剂A83
‑
01，0.3
‑
0.6μM；4
‑
(4
‑
氟苯基)
‑2‑
(4
‑
羟基苯基)
‑5‑
(4
‑
吡啶基)
‑
1H
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咪唑，0.2
‑
0.4μM；烟酰胺，3
‑
6mM。2.根据权利要求1所述的用于胸水来源类器官的培养基，其特征在于，胸水上清冻干粉在培养基中的浓度为100
‑
200μg/mL。3.根据权利要求2所述的用于胸水来源类器官的培养基，其特征在于，胸水上清冻干粉在培养基中的浓度为200μg/mL。4.根据权利要求1至3任一项所述的用于胸水来源类器官的培养基，其特征在于，添加剂包括以下终浓度的组分：人重组蛋白R
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Spondin 1，30ng/mL；头蛋白，100ng/mL；人重组蛋白rhEGF，8ng/mL；4
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羟乙基哌嗪乙磺酸，1mM；L
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丙氨酰

【专利技术属性】
技术研发人员：游明亮，邢华杨，刘松，赵婧，
申请(专利权)人：杭州艾名医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：