一种肿瘤类器官体系的气液交互界面培养基及气液交互培养方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种肿瘤类器官体系的气液交互界面培养基及气液交互培养方法。该培养基中含有T cell激活剂PHA

【技术实现步骤摘要】
一种肿瘤类器官体系的气液交互界面培养基及气液交互培养方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种肿瘤类器官体系的气液交互界面培养基及气液交互培养方法。

技术介绍

[0002]目前，免疫药物的疗效评估暂未有统一的方法。因为免疫治疗药物如免疫检查点抑制剂发挥作用需要体内肿瘤免疫微环境参与。利用患者肿瘤组织培养的肿瘤类器官，虽然在最初几代(一般是最初的1～2代)类器官中能检测出比例较低的免疫细胞，但这些免疫细胞数量和构成远无法代表患者体内肿瘤免疫微环境组成，而肿瘤微环境(Tumor microenvironment，TME)包括周围的血管、免疫细胞、成纤维细胞、骨髓源性炎性细胞、各种信号分子和细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)等，被认为是肿瘤发生和发展的关键因素。患者能否对免疫疗法产生应答，通常依赖于肿瘤细胞与肿瘤微环境内免疫调节的相互作用。因此单独的肿瘤类器官进行免疫治疗药物的药物敏感性检测准确性较低。
[0003]transwell细胞培养板主要用于各种细胞培养。transwell细胞培养板具有多个结构相同的孔，每个孔包括上室(小室)和下室，上室位于下室内，下室底部有通透性聚碳酸酯膜。培养时，上室可浸泡在下室培养基中，变构造出气
‑
液交互系统，即上室中的类器官既通过通透性聚碳酸酯膜的一面接触下室类器官培养基，而另一面又可以充分接触空气。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是提供一种肿瘤类器官体系的气液交互界面培养基及气液交互培养方法。
[0005]本专利技术解决上述技术问题的技术方案如下：
[0006]本专利技术提供一种肿瘤类器官体系的气液交互界面培养基，所述气液交互界面培养基的成分包括基础培养基Advanced DMEM/F12、Glutamax添加剂、烟酰胺、B27、p38MAPK抑制剂SB202190、A8301、ROCK抑制剂Y
‑
27632、FGF
‑
10、R
‑
spondin1重组蛋白、Noggin蛋白、EGF、Gasrtin、Wnt 3A、IL
‑
2、T cell激活剂PHA
‑
M以及浅蓝霉素。
[0007]进一步，所述T cell激活剂PHA
‑
M在所述气液交互界面培养基中的浓度为5
‑
15μg/mL。
[0008]进一步，所述浅蓝霉素在所述气液交互界面培养基中的浓度为0.5
‑
2μmol/L。
[0009]进一步，还包括pH缓冲液、抗菌剂和抗氧化剂；所述pH缓冲液为HEPES，所述抗菌剂为青链霉素，所述氧化剂为N
‑
乙酰半胱氨酸。
[0010]进一步，所述气液交互界面培养基中各成分的浓度为，所述气液交互界面培养基中，Glutamax的浓度为1
×
、HEPES的浓度为1
×
、N
‑
乙酰半胱氨酸的浓度为1
‑
1.25mmol/L、烟酰胺的浓度为8
‑
10mmol/L、青链霉素的浓度为1
×
、B27的浓度为1
×
、p38MAPK抑制剂SB202190的浓度为8
‑
10mmol/L、A8301的浓度为400
‑
500nmol/L、ROCK抑制剂Y
‑
27632的浓度
为8
‑
10mmol/L、FGF
‑
10的浓度为15
‑
20μg/L、R
‑
spondin1重组蛋白的浓度为350
‑
500ng/mL、Noggin蛋白的浓度为80
‑
100ng/mL、EGF的浓度为35
‑
50ng/mL、Gasrtin的浓度为8
‑
10nmol/L、Wnt 3A的浓度为80
‑
100ng/mL、IL
‑
2的浓度为4000
‑
6000IU/mL；溶剂为Advanced DMEM/F12基础培养基。
[0011]本专利技术还提供一种肿瘤类器官体系的气液交互培养方法，采用所述的气液交互界面培养基对含有肿瘤类器官的组织凝胶进行培养，得到肿瘤类器官体系。
[0012]进一步，采用transwell细胞培养板进行培养，包括以下步骤：
[0013]S1、采用基质胶进行包被，使transwell细胞培养板的上室中形成基质胶层；
[0014]S2、对获得的样本进行处理，得到含有肿瘤类器官的组织凝胶；
[0015]S3、向步骤S1中得到的所述基质胶层上加入所述组织凝胶，凝固后得到组织凝胶层；
[0016]S4、进行气液交互处理，具体方式为：分别在所述transwell细胞培养板的上室和下室中加入所述气液交互界面培养基，使所述组织凝胶层完全浸没在所述气液交互界面培养基中，浸时间为3天，
[0017]S5、吸出上室和下室中的气液交互界面培养基，然后在下室中加入新的所述气液交互界面培养基，使所述气液交互界面培养基的液面淹没所述基质胶层，并与所述组织凝胶层的下界面接触；
[0018]S6、培养20
‑
30天并经过传代后，得到肿瘤类器官体系。
[0019]进一步，所述步骤S1中，包被的具体方式为，每孔取80μL取所述基质胶加入所述上室中，再将所述transwell细胞培养板在37℃的环境下放置30min，得到所述基质胶层；所述步骤S3中，每孔取50uL所述组织凝胶加入所述基质胶层上，再将所述transwell细胞培养板在37℃的环境下放置30min，得到所述组织凝胶层。
[0020]进一步，所述步骤S2中，所述样本为通过合法途径取得的临床；所述样本的处理方法为，将所述肿瘤组织在清洗液中清洗，清洗后将其破碎至匀浆状，采用基质胶将匀浆状的所述肿瘤组织重悬，得到所述组织凝胶。
[0021]进一步，所述肿瘤类器官体系包括肿瘤类器官、T细胞和成纤维细胞。
[0022]本专利技术的有益效果为：
[0023](1)本专利技术的肿瘤类器官体系的气液交互界面培养基，通过加入T cell激活剂PHA
‑
M和浅蓝霉素(Caerulomycin A)，在刺激T cell激活的同时，能够增强TGF
‑
β
‑
Smad3信号通路，肿瘤细胞产生的溶血磷脂酸与TGF
‑
β可以协同作用促进成纤维细胞分化为CAF，有助于提高肿瘤类器官体系中，免疫、上皮和间质组分的含量；PHA
‑
M和Caerulomycin A可以通过调节信号转导途径、基因表达或代谢来控制细胞生长代谢过程，且对免疫细胞的形成有重要作用，从而提高肿瘤类器官体系培养的成功率；
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种肿瘤类器官体系的气液交互界面培养基，其特征在于，所述气液交互界面培养基的成分包括Advanced DMEM/F12基础培养基、Glutamax添加剂、烟酰胺、B27、p38MAPK抑制剂SB202190、A8301、ROCK抑制剂Y
‑
27632、FGF
‑
10、R
‑
spondin1重组蛋白、Noggin蛋白、EGF、Gasrtin、Wnt 3A、IL
‑
2、T cell激活剂PHA
‑
M以及浅蓝霉素。2.根据权利要求1所述一种肿瘤类器官体系的气液交互界面培养基，其特征在于，还包括pH缓冲液、抗菌剂和抗氧化剂；所述pH缓冲液为HEPES，所述抗菌剂为青链霉素，所述氧化剂为N
‑
乙酰半胱氨酸。3.根据权利要求2所述一种肿瘤类器官体系的气液交互界面培养基，其特征在于，所述T cell激活剂PHA
‑
M在所述气液交互界面培养基中的浓度为5
‑
15μg/mL；所述浅蓝霉素在所述气液交互界面培养基中的浓度为0.5
‑
2μmol/L。4.根据权利要求3所述一种肿瘤类器官体系的气液交互界面培养基，其特征在于，所述T cell激活剂PHA
‑
M在所述气液交互界面培养基中的浓度为10μg/mL，所述浅蓝霉素在所述气液交互界面培养基中的浓度为1μmol/L。5.根据权利要求3所述一种肿瘤类器官体系的气液交互界面培养基，其特征在于，所述气液交互界面培养基中，Glutamax添加剂的浓度为1
×
、HEPES的浓度为1
×
、N
‑
乙酰半胱氨酸的浓度为1
‑
1.25mmol/L、烟酰胺的浓度为8
‑
10mmol/L、青链霉素的浓度为1
×
、B27的浓度为1
×
、p38MAPK抑制剂SB202190的浓度为8
‑
10mmol/L、A8301的浓度为400
‑
500nmol/L、ROCK抑制剂Y
‑
27632的浓度为8
‑
10mmol/L、FGF
‑
10的浓度为15
‑
20μg/L、R
‑
spondin1重组蛋白的浓度为350
‑
500ng/mL、Noggin蛋白的浓度为80

【专利技术属性】
技术研发人员：邢华杨，游明亮，刘蕊，蔡超杰，
申请(专利权)人：杭州艾名医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：