一种小鼠肾类器官的培养基及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种小鼠肾类器官的培养基及其制备方法，涉及类器官培养领域，其包括基础培养基、特异性添加因子、CHIR99021和TTNPB；所述基础培养基为Advanced DMEM/F12；所述特异性添加因子包括：Glutamax，HEPES，N

【技术实现步骤摘要】
streptomycin、B27)浓度为100x的，x代表的就是100倍，一般情况下要稀释到相应的0.5
‑
1.5x，即0.5
‑
1.5倍。
[0011]本专利技术的有益效果是：本专利技术通过在肾类器官培养基中加入添加Wnt通路激活剂CHIR99021和芳香维甲酸TTNPB(Arotinoid Acid)，激活Wnt通路和视黄酸(RA)途径有助于促进肾脏的多种细胞类型的分化并形成肾小管样结构的形成；此外，若在培养基中添加如激活素A和BMP
‑
7，价格昂贵，并且它们在不同批次之间的效果不一致，本专利技术通过使用低分子量特异性添加因子的培养方法成本更低，一致性更高，小分子的特异性添加因子可以通过调节信号转导途径、基因表达或代谢来控制细胞过程，且对肾脏发育中输尿管芽的形成有重要作用，从而提高培养的成功率和小鼠肾类器官的生长速率。
[0012]在上述技术方案的基础上，本专利技术还可以做如下改进。
[0013]进一步，所述特异性添加因子包括：0.8
‑
1.2x Glutamax，0.8
‑
1.2x HEPES，0.8
‑
1.2mmol/L的N
‑
acetylcysteine，1.1
‑
1.4mmol/L的N
‑
Acetylcysteine，9
‑
11mmol/L的Nicotinamide，0.8
‑
1.2x Penicillin streptomycin，0.8
‑
1.2x B27，9
‑
11mmol/L的SB202190，480
‑
520nmol/L的A83
‑
01，9
‑
11mmol/L的Y
‑
27632，18
‑
22μg/L的FGF
‑
10，480
‑
520ng/mL的R
‑
spondin1，90
‑
110的ng/mL Noggin，及45
‑
55ng/mL的EGF；
[0014]所述CHIR99021的浓度为1
‑
3μmol/L，所述TTNPB的浓度为1
‑
2μmol/L。
[0015]进一步，所述特异性添加因子包括：1x Glutamax，1x HEPES，1mmol/L的N
‑
acetylcysteine，1.25mmol/L的N
‑
Acetylcysteine，10mmol/L的Nicotinamide，1x Penicillin streptomycin，1x B27，10mmol/L的SB202190，500nmol/L的A83
‑
01，10mmol/L的Y
‑
27632，20μg/L的FGF
‑
10，500ng/mL的R
‑
spondin1，100ng/mL的Noggin，50ng/mL的EGF；
[0016]所述CHIR99021的浓度为2μmol/L，所述TTNPB的浓度为1.5μmol/L。
[0017]进一步，所述特异性添加因子包括：1.1x Glutamax，1.1x HEPES，1.1mmol/L的N
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acetylcysteine，1.3mmol/L的N
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Acetylcysteine，11mmol/L的Nicotinamide，1.1x Penicillin streptomycin，1.1x B27，11mmol/L的SB202190，510nmol/L的A83
‑
01，11mmol/L的Y
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27632，21μg/L的FGF
‑
10，510ng/mL的R
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spondin1，110ng/mL的Noggin，55ng/mL的EGF；
[0018]所述CHIR99021的浓度为2.2μmol/L，所述TTNPB的浓度为1.6μmol/L。
[0019]进一步，所述特异性添加因子包括：0.9x Glutamax，0.9x HEPES，0.9mmol/L的N
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acetylcysteine，1.2mmol/L的N
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Acetylcysteine，9mmol/L的Nicotinamide，0.9x Penicillin streptomycin，0.9x B27，9mmol/L的SB202190，490nmol/L的A83
‑
01，9mmol/L的Y
‑
27632，19μg/L的FGF
‑
10，490ng/mL的R
‑
spondin1，95ng/mL的Noggin，48ng/mL的EGF；
[0020]所述CHIR99021的浓度为1.8μmol/L，所述TTNPB的浓度为1.4μmol/L。
[0021]本专利技术的第二个目的是一种小鼠肾类器官的制备方法，包括如下步骤：
[0022]步骤1：取小鼠肾脏组织剪碎，加入消化液，进行摇床消化，离心去除所述消化液，加入DPBS终止消化，滤网收集细胞悬液，将细胞悬液进行离心去除上清液，收集沉淀细胞；
[0023]步骤2：取步骤1收集的所述沉淀细胞，用上述所述的培养基重悬所述沉淀细胞，与相当于重悬的所述沉淀细胞的1.5
‑
2倍体积的matrigel混合，得到所述沉淀细胞的悬液；
[0024]步骤3：将步骤2得到的所述悬液滴于孔板的孔正中心部位，将所述孔板静置，使Marteigel凝固，所述孔板的每孔加入上述所述的培养基，置于细胞培养箱中培养，当加入的所述培养基变黄后更换新的所述培养基或者传代。
[0025]本专利技术采用上述方案的有益效果是：本专利技术通过采用上述的培养基进行小鼠肾类器官的制备，提高肾类器官的增殖速度、肾类器官样本的成功率，缩短类器官的构建时间；且用于后续实验时可无需进行原代扩展。
[0026]进一步，若步骤1中收集的所述沉淀细胞中红细胞的数量含量大于2
×
105时，取红细胞裂解液重悬所述沉淀细胞，进行裂解，加入细胞裂解液两倍体积的DPBS终止裂解，离心去除上清液，再次收集沉淀细胞，用于步骤2至3。
[0027]进一步，步骤1的具体的过程为：取小鼠肾脏组织剪碎，加入消化液I，置于37℃培养箱中摇床消化40
‑
60min，离心去除所述消化液I，加入相当于所述消化液I体积用量的0.4
‑
0.6倍的消化液II，置于37℃培养箱中摇床消化5
‑
15min，加入DPBS终止消化，滤网收集细胞悬液，将所述细胞悬液在1200
‑
1400rpm下离心2...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种小鼠肾类器官的培养基，其特征在于，其包括基础培养基、特异性添加因子、CHIR99021和TTNPB；所述基础培养基为Advanced DMEM/F12；所述特异性添加因子包括：0.5
‑
1.5x Glutamax，0.5
‑
1.5x HEPES，0.5
‑
1.5mmol/L的N
‑
acetylcysteine，1
‑
1.5mmol/L的N
‑
Acetylcysteine，8
‑
12mmol/L的Nicotinamide，0.5
‑
1.5x Penicillin streptomycin，0.5
‑
1.5x B27，8
‑
12mmol/L的SB202190，450
‑
550nmol/L的A83
‑
01，8
‑
12mmol/L的Y
‑
27632，15
‑
25μg/L的FGF
‑
10，450
‑
550ng/mL的R
‑
spondin1，80
‑
120的ng/mL Noggin，及40
‑
60ng/mL的EGF；所述CHIR99021的浓度为0.5
‑
4μmol/L，所述TTNPB的浓度为0.5
‑
3μmol/L。2.根据权利要求1所述一种小鼠肾类器官的培养基，其特征在于，所述特异性添加因子包括：0.8
‑
1.2x Glutamax，0.8
‑
1.2x HEPES，0.8
‑
1.2mmol/L的N
‑
acetylcysteine，1.1
‑
1.4mmol/L的N
‑
Acetylcysteine，9
‑
11mmol/L的Nicotinamide，0.8
‑
1.2x Penicillin streptomycin，0.8
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1.2x B27，9
‑
11mmol/L的SB202190，480
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520nmol/L的A83
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01，9
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11mmol/L的Y
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27632，18
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22μg/L的FGF
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10，480
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520ng/mL的R
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spondin1，90
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110的ng/mL Noggin，及45
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55ng/mL的EGF；所述CHIR99021的浓度为1
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3μmol/L，所述TTNPB的浓度为1
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2μmol/L。3.根据权利要求1所述一种小鼠肾类器官的培养基，其特征在于，所述特异性添加因子包括：1x Glutamax，1x HEPES，1mmol/L的N
‑
acetylcysteine，1.25mmol/L的N
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Acetylcysteine，10mmol/L的Nicotinamide，1x Penicillin streptomycin，1x B27，10mmol/L的SB202190，500nmol/L的A83
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01，10mmol/L的Y
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27632，20μg/L的FGF
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10，500ng/mL的R
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spondin1，100ng/mL的Noggin，50ng/mL的EGF；所述CHIR99021的浓度为2μmol/L，所述TTNPB的浓度为1.5μmol/L。4.根据权利要求1所述一种小鼠肾类器官的培养基...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢华杨，刘蕊，刘松，游明亮，
申请(专利权)人：杭州艾名医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：