原代猪肝细胞增殖培养基和原代猪肝细胞的增殖培养方法技术

本发明专利技术提供了一种原代猪肝细胞增殖培养基和原代猪肝细胞的增殖培养方法，涉及生物技术领域。本发明专利技术提供的原代猪肝细胞增殖培养基由液体基础培养基、细胞培养营养添加物、生长因子、转化生长因子

【技术实现步骤摘要】
原代猪肝细胞增殖培养基和原代猪肝细胞的增殖培养方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其是涉及一种原代猪肝细胞增殖培养基和原代猪肝细胞的增殖培养方法。

技术介绍

[0002]肝脏衰竭的治疗目前仍然是一个世界性的难题，生物人工肝(BAL)是目前肝衰竭治疗的主要有效手段之一和研究热点。选用合适的肝细胞是生物人工肝(BAL)的核心问题，目前用于生物人工肝的肝细胞主要有人肝细胞、肝肿瘤细胞株以及异种动物肝细胞，由于人肝细胞获取困难和肝肿瘤细胞株潜在的致瘤性，异种动物肝细胞被广泛应用于生物人工肝的研究中。其中，猪肝细胞由于其容易大量获取、大小及结构与人肝细胞相似、生理和代谢功能与人肝细胞最为接近等特点，已成为生物人工肝中应用最多的异种动物肝细胞。然而，原代猪肝细胞在体外存活时间短，不易在体外长期培养，这些都限制了其在生物人工肝中的应用。因此，一种稳定有效的原代猪肝细胞体外长期培养方法及培养基显得至关重要。
[0003]公开号为CN1869205A的中国专利技术专利申请公开了，采用逆转录病毒载体的方法将SV40大T抗原基因和人端粒酶逆转录酶导入到原代猪肝细胞，以此实现原代猪肝细胞的体外长期培养。但这种方法将整个病毒基因组导入了细胞，有潜在的致瘤性，因此在临床应用中受到限制。
[0004]公开号为CN109022348A的中国专利技术专利申请公开了，一种简单高效的分离培养猪原代肝细胞的方法，但该方法仅注重于分离获得数量多、活性高的原代猪肝细胞，所用培养基为H
‑
DMEM培养基，含10％胎牛血清，100u/ml的青霉素、100u/ml的链霉素的双抗，5ug/ml的胰岛素，并不能让原代猪肝细胞在体外长期培养。公开号为CN107043738A的中国专利技术专利申请公开了，一种用于培养原代猪肝细胞的无血清培养基，该培养基能保持原代猪肝细胞的生物特性与生物学功能，但也无法令原代猪肝细胞在体外长期培养。
[0005]目前，尚未有专利报道一种用于原代猪肝细胞体外长期培养的培养基。
[0006]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0007]本专利技术的第一目的在于提供一种原代猪肝细胞增殖培养基，该培养基能够实现肝细胞的体外长期培养，以解决上述问题。
[0008]本专利技术的第二目的在于提供一种原代猪肝细胞的增殖培养方法。
[0009]第一方面，本专利技术提供了一种原代猪肝细胞增殖培养基，由如下组分组成：
[0010]液体基础培养基、细胞培养营养添加物、生长因子、转化生长因子
‑
β通路抑制剂、WNT信号通路活化剂、活性氧清除剂、牛磺酸、半乳糖、抗菌素和血清。
[0011]作为进一步技术方案，所述液体基础培养基包括DMEM、DMEM/F12、William
’
s E和RPMI1640中的至少一种；
[0012]优选地，所述血清的体积占比为1％
‑
20％；
[0013]优选地，所述牛磺酸的浓度为0.1
‑
10mM；
[0014]优选地，所述半乳糖的浓度为0.1
‑
1g/L。
[0015]作为进一步技术方案，所述抗菌素包括青霉素
‑
链霉素溶液、青霉素
‑
链霉素
‑
两性霉素B混合溶液和青霉素
‑
链霉素
‑
庆大霉素混合溶液中的至少一种，所述抗菌素的体积占比为1％
‑
3％。
[0016]作为进一步技术方案，所述细胞培养营养添加物包括L
‑
丙氨酰
‑
谷氨酰胺、N
‑
2无血清添加剂和B
‑
27无血清添加剂中的至少一种；
[0017]所述L
‑
丙氨酰
‑
谷氨酰胺的体积占比为0.1％
‑
2％；
[0018]所述N
‑
2无血清添加剂的体积占比为0.1％
‑
3％；
[0019]所述B
‑
27无血清添加剂的体积占比为0.1％
‑
3％。
[0020]作为进一步技术方案，所述生长因子包括表皮生长因子、肝细胞生长因子和血小板衍生生长因子中的至少一种；
[0021]所述表皮生长因子的浓度为1
‑
50ng/ml；
[0022]所述肝细胞生长因子的浓度为1
‑
50ng/ml；
[0023]所述血小板衍生生长因子的浓度为1
‑
100ng/ml；
[0024]作为进一步技术方案，所述转化生长因子
‑
β通路抑制剂包括SB431542、LY364947、K02288和A
‑
83
‑
01中的至少一种；
[0025]所述SB431542的浓度为0.01
‑
10uM；
[0026]所述LY364947的浓度为0.01
‑
5uM；
[0027]所述K02288的浓度为0.01
‑
10uM；
[0028]所述A
‑
83
‑
01的浓度为0.01
‑
5uM。
[0029]作为进一步技术方案，所述WNT信号通路活化剂包括重组Wnt3a蛋白和糖原合成酶激酶3β抑制剂中的至少一种；
[0030]所述糖原合成酶激酶3β抑制剂包括CHIR99021和TWS119中的至少一种；
[0031]所述重组Wnt3a蛋白的浓度为1
‑
50ng/ml；
[0032]所述CHIR99021的浓度为1
‑
10uM；
[0033]所述TWS119的浓度为1
‑
50uM。
[0034]作为进一步技术方案，所述活性氧清除剂包括丙酮酸钠、N
‑
乙酰基
‑
L
‑
半胱氨酸、DPI和维生素C中的至少一种；
[0035]所述丙酮酸钠的浓度为0.01
‑
1uM；
[0036]所述N
‑
乙酰基
‑
L
‑
半胱氨酸的浓度为0.01
‑
2uM；
[0037]所述DPI的浓度为0.01
‑
5uM；
[0038]所述维生素C的浓度为1
‑
20ug/ml。
[0039]作为进一步技术方案，原代猪肝细胞增殖培养基由如下组分组成：
[0040]William
’
s E液体基础培养基、N
‑
2无血清添加剂1.5vol％、B
‑
27无血清添加剂2vol％、L
‑
丙氨酰
‑
谷氨本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种原代猪肝细胞增殖培养基，其特征在于，由如下组分组成：液体基础培养基、细胞培养营养添加物、生长因子、转化生长因子
‑
β通路抑制剂、WNT信号通路活化剂、活性氧清除剂、牛磺酸、半乳糖、抗菌素和血清。2.根据权利要求1所述的原代猪肝细胞增殖培养基，其特征在于，所述液体基础培养基包括DMEM、DMEM/F12、William
’
s E和RPMI1640中的至少一种；优选地，所述血清的体积占比为1％
‑
20％；优选地，所述牛磺酸的浓度为0.1
‑
10mM；优选地，所述半乳糖的浓度为0.1
‑
1g/L。3.根据权利要求1所述的原代猪肝细胞增殖培养基，其特征在于，所述抗菌素包括青霉素
‑
链霉素溶液、青霉素
‑
链霉素
‑
两性霉素B混合溶液和青霉素
‑
链霉素
‑
庆大霉素混合溶液中的至少一种，所述抗菌素的体积占比为1％
‑
3％。4.根据权利要求1所述的原代猪肝细胞增殖培养基，其特征在于，所述细胞培养营养添加物包括L
‑
丙氨酰
‑
谷氨酰胺、N
‑
2无血清添加剂和B
‑
27无血清添加剂中的至少一种；所述L
‑
丙氨酰
‑
谷氨酰胺的体积占比为0.1％
‑
2％；所述N
‑
2无血清添加剂的体积占比为0.1％
‑
3％；所述B
‑
27无血清添加剂的体积占比为0.1％
‑
3％。5.根据权利要求1所述的原代猪肝细胞增殖培养基，其特征在于，所述生长因子包括表皮生长因子、肝细胞生长因子和血小板衍生生长因子中的至少一种；所述表皮生长因子的浓度为1
‑
50ng/ml；所述肝细胞生长因子的浓度为1
‑
50ng/ml；所述血小板衍生生长因子的浓度为1
‑
100ng/ml。6.根据权利要求1所述的原代猪肝细胞增殖培养基，其特征在于，所述转化生长因子
‑
β通路抑制剂包括SB431542、LY364947、K02288和A
‑
83
‑
01中的至少一种；所述SB431542的浓度为0.01
‑
10uM；所述LY364947的浓度为0.01
...

【专利技术属性】
技术研发人员：高毅，曾敏，张惠娟，
申请(专利权)人：广东乾晖生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：