诱导肝细胞分化为胆管细胞的培养方法及所使用的孵育液技术

本申请公开一种能诱导肝细胞分化为胆管细胞的孵育液及所使用的孵育液。孵育液包括：雷帕霉素，终浓度为1～20μM；表皮生长因子，终浓度为5～10ng/ml；DMSO，终浓度不超过0.1％；余量为基础培养基。进一步地，本申请还利用前述的孵育液提供一种诱导肝细胞分化为胆管细胞的培养方法：活化目标肝细胞；配制孵育液，用于诱导目标肝细胞分化为胆管细胞；利用所述孵育液对所述活化后的目标肝细胞进行预设天数的连续培养，所述预设天数为5～12天。本申请的孵育液成分简单，诱导方法操作简单、诱导成功率高，适用性广。适用性广。适用性广。

【技术实现步骤摘要】
诱导肝细胞分化为胆管细胞的培养方法及所使用的孵育液


[0001]本申请涉及细胞培养领域，尤其涉及一种诱导肝细胞分化为胆管细胞的培养方法及所使用的孵育液。

技术介绍

[0002]肝脏由两种类型的内皮层上皮细胞组成，肝细胞和胆管细胞，两者都由肝祖细胞分化。肝细胞是一种肝实质细胞，提供多种代谢功能，如糖生成、糖异生、尿素合成和脂质合成等。胆管细胞形成具有空腔结构的胆管，胆管连接肝和肠，分泌肝细胞产生的胆汁进入肠。尽管胆管细胞只占肝脏的一小部分，但胆管细胞的异常导致多种肝脏疾病的发生，包括原发性胆汁性肝硬化、原发性硬化性胆管炎、肝癌和酒精性肝。
[0003]然而对胆管细胞的研究仍未深入，其中一个原因是胆管细胞来源受限，既难于从通过分离获得原代细胞，也难以通过传代培养获得稳定的胆管细胞，诱导分化而得的胆管细胞存在功能缺陷。

技术实现思路

[0004]本申请的目的是，至少部分克服现有技术的不足，提供一种成分简单、成本可控、操作简易的诱导肝细胞分化为胆管细胞的培养方法及所使用的孵育液。
[0005]为达到以上技术目的，本申请采用的技术方案如下：
[0006]第一方面，提供一种能诱导肝细胞分化为胆管细胞的孵育液，其由以下组分组成：雷帕霉素，终浓度为1～20μM；
[0007]表皮生长因子，终浓度为5～10ng/ml；
[0008]DMSO，终浓度不超过0.1％；
[0009]余量为基础培养基，所述基础培养基选自DMEM/F12细胞培养基、F12细胞培养基和William's E细胞培养基中的一种。
[0010]优选地，所述雷帕霉素的质量与DMSO的体积比不超过1：1000。
[0011]第二方面，提供一种诱导肝细胞分化为胆管细胞的培养方法，包括以下步骤：
[0012]活化目标肝细胞；
[0013]配制孵育液，用于诱导目标肝细胞分化为胆管细胞；
[0014]利用所述孵育液对所述活化后的目标肝细胞进行预设天数的连续培养，所述预设天数为5～12天；
[0015]其中，所述孵育液采用如前所述的能诱导肝细胞分化为胆管细胞的孵育液。
[0016]可选择地，所述目标肝细胞来自肝祖细胞，肝癌细胞和胆管癌细胞中的其中一种。
[0017]进一步地，含有诱导分化的胆管细胞使细胞团形成微观的腔体结构。
[0018]更进一步地，含有诱导分化的胆管细胞的细胞团中的钙粘蛋白基因和角蛋白18基因表达提高。
[0019]可选择地，所述活化后的目标肝细胞在以下任意一种培养容器中孵育：平板培养
容器、低粘附孔板或低粘附微球板。
[0020]进一步可选择地，所述活化后的目标肝细胞按照每50ml培养基接种细胞数量小于或等于2x107的要求加入所述的孵育液。
[0021]优选地，在预设天数之内，每隔24h更换所述孵育液，并且保持所述目标肝细胞的生长密度维持在90％以上。
[0022]具体地，所述活化目标肝细胞，具体为将贴壁培养的目标肝细胞依次进行消化、重悬和接种至新的贴壁培养容器，直至所述目标肝细胞的贴壁生长密度达到90％。
[0023]与现有技术相比较，本申请具有如下优势：
[0024](1)本申请的孵育液，成分简单，各组分都有成熟的销售商品，容易获取、价格相对低廉，孵育液的配制方法简单，能有效控制各方面的应用成本。
[0025](2)本申请的孵育液，可以使用多种常用的基础培养基进行配制，可以适应不同细胞株或细胞系的肝细胞，为胆管细胞的诱导分化提供了多种细胞来源。
[0026](3)本申请的诱导培养方法基于本申请的孵育液，操作简单、诱导成功率高，适用性广。
附图说明
[0027]图1为采用本申请培养的HepaRG细胞，二维培养6天后，荧光染色标志物之钙粘蛋白(E
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Cadherin，E
‑
CAD)和角蛋白18(CK18)的观察结果。
[0028]图2为采用本申请培养的HepaRG细胞，三维培养12天后，荧光染色标志物之钙粘蛋白(E
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Cadherin，绿色荧光)、增殖蛋白(PCNA，红色荧光)和胆腔结构的观察结果。
[0029]图3为采用本申请培养的HepaRG细胞，三维培养12天后，荧光观察染色标志物之钙粘蛋白(N
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Cadherin，N
‑
CAD，绿色荧光)和明显的胆管腔体结构的观察结果。
[0030]图4为采用本申请培养的HepaRG细胞，三维培养12天后，CK18，E
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CAD，N
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CAD的基因表达水平柱状图。
具体实施方式
[0031]以下结合附图和具体实施方式对本申请作进一步详细描述。
[0032]肝脏含有两种类型的上皮细胞，称为肝细胞和胆管细胞，它们在发育过程中来源于肝母细胞(胎儿肝干细胞或肝祖细胞)。胆管细胞是形成胆管小管的胆道上皮细胞。胆管连接肝脏和肠道，排出肝细胞分泌的胆汁。通常认为，当胆管细胞建立管状结构时，就具备了包括分泌和屏障功能在内的上皮特征。
[0033]本申请提供一种能诱导肝细胞分化为胆管细胞的孵育液，用于在二维或三维条件下，诱导肝细胞分化为胆管细胞，所分化的胆管细胞自发组织为腔体结构，该腔体结构为功能性导管结构的前体结构。
[0034]本申请的孵育液，其由以下组分组成：雷帕霉素，终浓度为1～20μM；表皮生长因子，终浓度为5～10ng/ml；DMSO，终浓度不超过0.1％；余量为基础培养基。
[0035]所述基础培养基，选自DMEM/F12细胞培养基、F12细胞培养基和William's E细胞培养基中的一种。DMEM/F
‑
12(Dulbecco's Modified EagleMedium/Nutrient Mixture F
‑
12)是一种广泛使用的基础培养基，用于支持多种哺乳动物细胞的生长，主要含有3.15g/L
葡萄糖、0.365g/L L
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谷氨酰胺、酚红、碳酸氢钠以及3.57g/L HEPES。F12细胞培养基又叫Ham
′
s F12培养基，是为在低血清浓度下克隆CHO细胞而设计的，现在也广泛应用于克隆形成率的分析及原代培养，由于营养成分丰富，且可以使用较少血清，故也常作为无血清培养基的基础培养基，主要含有146mg/LL
‑
谷氨酰胺，1802mg/LD
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葡萄糖，110mg/L丙酮酸钠，1176mg/L碳酸氢钠，pH值7.2
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7.4。William'sE培养基是早期培养基(富含氨基酸，葡萄糖含量加倍)的改良产品，William'sE培养基中含有独特的成分，包括锌、铁、锰、非必需氨基酸、还原剂谷胱甘肽和脂质亚油酸甲酯，含酚红，不含L
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谷氨酰胺和HEPES。本申请的实施例可以根据目标肝细胞的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种能诱导肝细胞分化为胆管细胞的孵育液，其特征在于，其由以下组分组成：雷帕霉素，终浓度为1～20μM；表皮生长因子，终浓度为5～10ng/ml；DMSO，终浓度不超过0.1％；余量为基础培养基，所述基础培养基选自DMEM/F12细胞培养基、F12细胞培养基和William's E细胞培养基中的一种。2.如权利要求1所述的孵育液，其特征在于，所述雷帕霉素的质量与DMSO的体积比不超过1：1000。3.一种诱导肝细胞分化为胆管细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：活化目标肝细胞；配制孵育液，用于诱导目标肝细胞分化为胆管细胞；利用所述孵育液对所述活化后的目标肝细胞进行预设天数的连续培养，所述预设天数为5～12天；其中，所述孵育液采用如权利要求1或2所述的能诱导肝细胞分化为胆管细胞的孵育液。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述目标肝细胞来自肝祖细胞，肝癌细胞和胆管癌细胞中的其中一...

【专利技术属性】
技术研发人员：高毅，黎少，欧楚澎，彭青，李阳，
申请(专利权)人：广东乾晖生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：