一种人工组织体外重建方法技术

本文提供了一种人工组织体外重建的方法，所述体外组织重建方法通过ECM结合多细胞共培养重建具有免疫微环境的肿瘤组织。养重建具有免疫微环境的肿瘤组织。养重建具有免疫微环境的肿瘤组织。

【技术实现步骤摘要】
一种人工组织体外重建方法


[0001]本专利技术属于组织工程和再生医学领域备方法，具体涉及一种免疫微环境的肿瘤组织体外重建的方法。

技术介绍

[0002]癌症严重影响人类生命健康，是中国以及发达国家最主要的死亡原因。《中国和美国的癌症统计数据2022》显示，中国的癌症医疗负担不断加大，死亡率居全球第一。虽然永生化细胞系的研究方法加深了对癌症的理解，但是平面培养的方式限制了其发展，因此，开发一种人工肿瘤组织的体外重建方法，对癌症研究具有重要意义。
[0003]生物体内肿瘤组织具有特殊的微环境，进行体外肿瘤组织重建需结合生物学、组织工程和仿生刺激进行整体仿生设计。以肝肿瘤组织为例，其组织由多细胞和细胞外基质(ECM)构成，细胞外基质为细胞提供细胞黏附点位与力学支持，基质细胞通过旁分泌促进肝肿瘤细胞迁移，免疫细胞维持肝肿瘤干细胞的干性，增强其耐药性。要实现组织重建，就需构建具有原始组织特有的微环境，利用其特有的生理结构调控组织再生，实现组织的特异功能。

技术实现思路

[0004]本专利技术目的在于开发一种具有免疫微环境的人工肿瘤组织体外重建方法，通过多细胞共培养和ECM提供的生物线索，重塑组织微环境，重建肿瘤组织并实现一定代谢功能。
[0005]申请人前期研究证实，具有免疫细胞的多细胞共培养能够让多细胞自发形成组织形态；此外，合适的ECM可提供力学支撑与结构框架，能够促进细胞的增殖和黏附。本专利技术基于前期研究结果，利用结合ECM共培养的方式，开发一种具有免疫微环境的肿瘤组织体外重建方法。其中多细胞通过细胞外基质供给、旁分泌作用、免疫反应和营养供给促进肿瘤组织形成，具有模拟体内肿瘤微环境的优势。所述ECM来源于器官脱细胞支架，含有丰富的层粘连蛋白、IV型胶原蛋白、生长因子和其他细胞外基质成分，提供力学支持与细胞附着位点。
[0006]所述重建方法中多细胞共培养方式模拟体内组织细胞类型，其细胞接种比例来源于原始人源细胞占比信息。
[0007]所述ECM支架材料结构多孔，易于细胞的渗透及氧气输送，通过器官脱细胞获得，方法简单且成本低廉，可批量生产，结合多细胞共培养技术，实现体外组织重建。
[0008]本文开发了一种具有免疫微环境的人工肿瘤组织体外重建方法，利用组织ECM结合多细胞共培养重建肿瘤组织。其中基质细胞通过上皮间质转化(EMT)促进肿瘤细胞增殖迁移，免疫细胞通过与肿瘤干细胞的互作维持其干性以及其周围的微环境。ECM的胶原蛋白基质能促进细胞的黏附、增殖、迁移及新细胞再生，同时其多孔结构提供足够的力学支撑并输送营养，维持组织重建期间的营养输送及力学刺激。
附图说明
[0009]图1为本专利技术中具有免疫微环境的人工肿瘤组织体外重建方法的设计图；
[0010]图2为申请人前期实验研究证实组织ECM支架能够促进癌细胞的增殖和黏附行为的分析结果；
[0011]图3为申请人前期实验中证实多细胞共培养有利于肿瘤组织成型的荧光染色结果；
[0012]图4为实施方案中的基于ECM脱细胞支架材料的电镜图；
[0013]图5为体外构建具有免疫微环境的人工肿瘤组织的三维立体图；
[0014]图6为体外肿瘤组织组织的代谢功能结果；
[0015]图7为培养30天后体外肿瘤组织的苏木精
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伊红(H&E)染色结果。
具体实施方案
[0016]1)人源肿瘤组织信息筛查
[0017]准备好磷酸缓冲液(PBS)以及高糖培养基(DMEM)，将手术刀具高温灭菌后，紫外照射1h后以待使用。
[0018]用PBS将从医院获取的人源肿瘤组织冲洗至组织表面没有明显血迹，使用手术刀具将肿瘤组织切成小块。再次使用PBS洗净后，用组织消化酶将其消化成细胞悬液，通过200目过滤网过滤较大组织块，使用流式抗体标记肿瘤细胞、基质细胞(内皮细胞和成纤维细胞)以及免疫细胞，通过流式细胞分析获取其各细胞占比信息。
[0019]2)基质细胞的间充质转化
[0020]肿瘤细胞传代培养至80％左右时，更换新鲜培养基继续培养，24h后收集培养上清，4℃1200rpm离心10min后获取条件培养基。
[0021]基质细胞进行传代培养，并在细胞汇合度为70％时，使用条件培养基进行条件培养。将基质细胞培养皿中的旧培养基吸去，PBS清洗3次，加入条件培养基和新鲜培养基(体积比：2:1)，活化72小时后将基质细胞转化为肿瘤相关基质细胞，期间每24h更换条件培养基。
[0022]3)ECM脱细胞支架的制备
[0023]配制含1％(v/v)聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X
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100)和0.5％(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)的磷酸缓冲盐溶液(PBS)溶液。
[0024]取新鲜(动物)组织并用去离子水冲洗干净，使用手术刀具将其分割成5cm3小块，将组织放入
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80℃反复冻融三次，随后将组织在含1％(v/v)Triton X
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100和0.5％(w/v)SDS的PBS溶液中搅拌，每两天更换溶液，重复上述过程多次，直至组织呈透明状。
[0025]将透明状组织样品用无菌PBS多次冲洗，去除残留Triton X
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100和SDS，最后使用75％医用酒精浸泡两小时，紫外照射1h，
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20℃保存备用。
[0026]4)体外肿瘤组织的构建及功能评估
[0027]将ECM脱细胞支架置于培养皿上，紫外照射2h，待其贴壁后使用DMEM浸泡1h。待肿瘤相关基质细胞、肿瘤细胞以及免疫细胞培养传代至细胞汇合度为90％左右时，吸出培养皿中的DMEM，根据肿瘤信息筛查确定的各细胞占比信息，将用100μl DMEM重悬三种类型细胞并将其接种于ECM支架上进行多细胞共培养。
[0028]待细胞黏附后，再添加适量DMEM培养，培养30天后，通过活细胞染色观察其三维组织形态，检测其葡萄糖消耗量以及乳酸产生量，评估其代谢功能，通过H&E染色评估其肿瘤组织重建程度。
[0029]上述以较佳的实例公开了本专利，然其并非用以限制本专利，凡采用等同替换或者等效替代方式所获取的技术方案，均落在本专利的保护范围之内。
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人工组织体外重建方法，其特征在于，所述方法使用ECM支架结合多细胞共培养的方式，通过细胞的间充质转化，根据人源肿瘤组织样本筛查信息接种相应细胞于ECM支架上形成组织，所述多细胞为基质细胞、肿瘤细胞和免疫细胞，所述ECM支架保留了大量的胶原蛋白，其残留双链DNA含量低于50ng，孔隙率高有利于细胞浸润。2.根据权利要求1所述的人工组织体外重建方法，其特征在于，所述间充质转化细胞为肿瘤相关成纤维细胞和肿瘤相关内皮细胞。3.根据权利要求1所述的人工组织体外重建方法，其特征在于，所述样本筛查信息包括各细胞数量占比和组织学特异性信息。4.根据权利要求1所述的人工组织体外重建方法，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭志凯，刘文宇，王建，
申请(专利权)人：湖南大学深圳研究院湖大粤港澳大湾区创新研究院，
类型：发明
国别省市：