无血清细胞培养体系及其细胞消化终止液制造技术

本申请公开一种细胞消化终止液，用于终止胰蛋白酶对体外贴壁培养细胞的消化进程，其包括以下组分：转铁蛋白，终浓度为5

【技术实现步骤摘要】
无血清细胞培养体系及其细胞消化终止液


[0001]本申请涉及细胞培养领域，尤其涉及无血清细胞培养体系及其细胞消化终止液。

技术介绍

[0002]目前，细胞的体外处理，包括收获后的运输和治疗制备，一般是在含有胎牛血清(fatal bovine serum，FBS)的培养基中进行的，它促进细胞的附着、增殖和分化。然而，由于FBS的使用存在安全问题，包括人畜共患病的潜在传播和移植排斥反应，因为FBS中的蛋白质和多肽被认为与培养的细胞结合，然后通过细胞移植过程转移到宿主，导致移植细胞的排斥反应因此临床处理细胞需要异种无血清培养基。
[0003]消除培养液中的血清和动物成分是确定细胞培养过程的重要一步。定义介质只包含具有已知化学特性的产品和材料，如小分子、盐和脂肪酸。这些培养基还可能包括动物系统中不产生的重组蛋白。加入无血清或无动物的培养基将在以下几个方面对细胞培养过程有好处：通过减少介质组成的可变性来提高一致性；简化对监管准则的遵从；如果原材料需要改变，简化可比性测试。
[0004]细胞脱离是培养贴壁细胞所必需的。胰蛋白酶化是最流行的分离技术，常规方式终止胰蛋白酶的消化作用是加入血清，然而在无血清的培养体系中，为了终止消化而引入血清，不符合临床要求。

技术实现思路

[0005]本申请的目的是，至少部分克服现有技术的不足，提供一种无血清的细胞消化终止液，并且利用该细胞消化终止液构建无血清细胞培养体系。
[0006]为达到以上技术目的，本申请采用的技术方案如下：
[0007]第一方面，提供一种细胞消化终止液，用于终止胰蛋白酶对体外贴壁培养细胞的消化进程，其包括以下组分：
[0008]转铁蛋白，终浓度为5
‑
10mg/mL；
[0009]胰岛素，终浓度为1
‑
5mg/mL；
[0010]维生素C，终浓度为5
‑
10μM；
[0011]次黄嘌呤钠，终浓度为5
‑
10mM；
[0012]胸苷，终浓度为1
‑
3mM；
[0013]非必需氨基酸溶液，稀释至每种氨基酸终含量为0.1mM。
[0014]可选择地，所述细胞消化终止液需加入基础培养基中使用，所述基础培养基选自DMEM/F12细胞培养基、F12细胞培养基和William's E细胞培养基中的一种。
[0015]可选择地，所述非必需氨基酸溶液为100倍浓缩液；所述非必需氨基酸溶液包含甘氨酸、L
‑
丙氨酸、L天冬酰胺、L
‑
天冬氨酸、L
‑
谷氨酸、L
‑
脯氨酸和L
‑
丝氨酸。
[0016]优选地，所述细胞消化终止液不含血清。
[0017]进一步可选择地，所述细胞消化终止液适用于二维培养的细胞和三维培养的细
胞。
[0018]可选择地，所述细胞消化终止液适用于体外培养的干细胞或肝细胞。
[0019]进一步地，所述细胞消化终止液适用于体外培养的人胚胎干细胞或肝癌细胞。
[0020]优选地，所述细胞消化终止液的工作温度为4℃。
[0021]进一步优选地，所述细胞消化终止液在胰蛋白酶消化细胞60min内加入以终止消化。
[0022]第二方面，提供一种无血清细胞培养体系，包括使用无血清细胞培养液和消化终止液，其特征在于，所述消化终止液采用如前所述的细胞消化终止液。
[0023]与现有技术相比较，本申请具有如下优势：
[0024](1)本申请的细胞消化终止液，经验证具备竞争性结合胰蛋白酶作用，使细胞蛋白和胰蛋白酶结合的机会大大减少，从而起着终止胰蛋白酶消化细胞的效果，有效替血清终止消化的作用；
[0025](2)本申请的细胞消化终止液与传统的含血清的终止液相比较，无明显的细胞毒性，在消化60min内加入对细胞活性的影响无明显差异；
[0026](3)本申请的细胞消化终止液的组成成分清楚，都是容易获取、价格相对低廉的成分，不会大幅度提高本申请的的制备成本；
[0027](4)本申请的细胞消化终止液，可以配合应用于多种基础培养基，可以适应不同细胞，为各种多类培养应用提供足够条件；不仅可以用于常规二维培养细胞，还可以用于在三维培养所形成的细胞球体，具有临床应用的良好前景。
附图说明
[0028]图1示出了本申请的无血清消化终止添加剂与其他配方的添加剂或培养基之间对细胞培养的影响。
[0029]图2示出了本申请的无血清消化终止添加剂，与10％胎牛血清作为对照组相比，对不同时间消化的MSC终止消化后，细胞活率柱状图；
[0030]图3示出了本申请的无血清消化终止添加剂对进行连续消化的MSC终止消化后，在消化时间60分钟左右，与10％胎牛血清作为对照组相比，细胞死活染色结果(10倍物镜)；
[0031]图4示出了申请的无血清消化终止添加剂对三维HepG2细胞培养物在消化时间60分钟左右，与10％胎牛血清作为对照组相比，终止消化后，细胞死活染色结果(10倍物镜)。
具体实施方式
[0032]以下结合附图和具体实施方式对本申请作进一步详细描述。
[0033]本申请提供一种细胞消化终止液，用于终止胰蛋白酶对体外贴壁培养细胞的消化进程，其包括以下组分：转铁蛋白，终浓度为5
‑
10mg/mL；胰岛素，终浓度为1
‑
5mg/mL；维生素C，终浓度为5
‑
10μM；次黄嘌呤钠，终浓度为5
‑
10mM；胸苷，终浓度为1
‑
3mM；非必需氨基酸溶液，稀释至每种氨基酸终含量为0.1mM。
[0034]转铁蛋白是一种铁载体，也有助于降低氧自由基和过氧化物的毒性水平。细胞在适当的时间需要适当数量的铁来维持健康并继续生长和分裂。铁太少或太多都会导致生长和生产力低下。在自然界中，铁通过铁结合蛋白转铁蛋白(存在于哺乳动物血液中)输送到
细胞中。转铁蛋白是一种万能的铁载体，通过受体介导的铁从转铁蛋白转移到细胞，将适量的铁输送到细胞。表面特定的转铁蛋白受体根据细胞对铁的需求上调或下调。由于细胞具有调节铁吸收的能力，转铁蛋白能够提供细胞所需的确切数量的铁。这很重要，因为它消除了细胞摄入过多铁元素而导致细胞损伤的问题，而其他铁元素来源也会导致细胞损伤。
[0035]胰岛素可促进葡萄糖和氨基酸的摄取、脂肪形成、细胞内运输以及蛋白和核酸的合成。胰岛素的作用主要是代谢，在哺乳动物细胞培养中以大约100倍的生理浓度添加重组胰岛素作为生长因子，具有抗凋亡和有丝分裂作用。
[0036]维生素C，又称抗坏血酸，是一种辅因子，在培养基中用作抗氧化剂。抗坏血酸是一种天然存在的内酯，由植物和许多动物产生，但不包括人类或其他灵长类动物。它作为电子供体(即还原剂)，并显示出抗氧化活性，特别是对活性氧。抗坏血酸保护细胞免受辐射和氧自本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞消化终止液，用于终止胰蛋白酶对体外贴壁培养细胞的消化进程，其特征在于，其包括以下组分：转铁蛋白，终浓度为5
‑
10mg/mL；胰岛素，终浓度为1
‑
5mg/mL；维生素C，终浓度为5
‑
10μM；次黄嘌呤钠，终浓度为5
‑
10mM；胸苷，终浓度为1
‑
3mM；非必需氨基酸溶液，稀释至每种氨基酸终含量为0.1mM。2.如权利要求1所述的细胞消化终止液，其特征在于，所述细胞消化终止液需加入基础培养基中使用，所述基础培养基选自DMEM/F12细胞培养基、F12细胞培养基和William's E细胞培养基中的一种。3.如权利要求1所述的细胞消化终止液，其特征在于，所述非必需氨基酸溶液为100倍浓缩液；所述非必需氨基酸溶液包含甘氨酸、L
‑
丙氨酸、L天冬酰胺、L
‑
天冬氨酸、...

【专利技术属性】
技术研发人员：高毅，黎少，欧楚澎，彭青，李阳，
申请(专利权)人：广东乾晖生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：