用于产生间充质干细胞的培养基和方法技术

本发明专利技术公开一种能够促进多能干细胞(PSCs)分化为间充质干细胞(MSCs)或促进MSCs的增生的培养基。公开一种将PSCs分化为MSCs的方法。进一步公开一种在不分化的情况下增生MSCs的方法。MSCs的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于产生间充质干细胞的培养基和方法
[0001]相关申请
[0002]本申请主张于2020年06月23日提交的美国专利临时申请案申请号为63/042,634的优先权，其公开内容通过引用并入本文作为参考。
[0003]
及
技术介绍

[0004]本专利技术在其一些实施例中是有关于一种用于培养多能干细胞的培养基，更具体地但不限于是有关于一种可用于将多能干细胞分化为间充质干细胞(MSCs)的新型培养基，以及可将MSCs维持在增殖、多能和未分化状态的新型培养培养基。
[0005]间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是具有多潜能和自我复制能力的干细胞。MSCs可以分化为多种细胞，包括属于间质的细胞，如成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞和肌细胞，以及神经细胞和肝细胞。此外，已知MSCs通过自身产生的体液因子具有旁分泌作用和细胞粘附相互作用。基于这些作用，MSCs发挥修复和再生目标组织和细胞的能力以及控制免疫反应的能力，例如在抗炎方面，从而对各种疾病提供治疗效果。MSCs可以来源于各种成人或胎儿组织(例如骨髓、胚胎卵黄囊、胎盘、脐带组织、脐带血、羊水和脂肪组织)。或者，可以分别从多能干细胞(PSCs)、胚胎干细胞(ESCs)或诱导干细胞(iPS细胞)中产生无限且可复制的胎儿或成人MSCs。
[0006]人胚胎干细胞(hESCs)可作为产生高质量人MSCs的可靠来源。hESC是增殖的、未分化的干细胞，能够分化为所有三个胚胎生殖层的细胞。此外，人胚胎干细胞可以无限期地在体外繁殖和扩增，为人类治疗提供了可能取之不尽、用之不竭的细胞来源。
[0007]人类iPS细胞是通过将基因(例如Oct4、Sox2、Klf4和c
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Myc，或Oct4，Sox2、Nanog和Lin28)导入体细胞而获得的诱导多能干细胞[高桥K，细胞期刊(2007)131:861
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872；和Yu J等人，科学期刊(2007)318:1917
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1920]。iPS细胞具有与人胚胎干细胞相似的特性，可以在特定的诱导条件下在体外和体内分化为三个胚胎生殖层的代表性组织。iPS细胞衍生方法的改进包括使用质粒代替病毒载体或不与基因组整合的衍生，这可能简化iPS细胞在临床应用中的使用[Yu J等人，科学期刊(2009)324:797
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801]。
[0008]有多种方法可以将人类ESC和iPS细胞分化为MSC。
[0009]美国专利公告号US 10351825提供了从iPS细胞产生MSCs的方法，其中iPS细胞在含有7至8vol.％的CO2的大气中在TGF
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β抑制剂(例如SB431542)的存在下培养20至35天。然后将细胞转移到具有亲水表面的培养皿中，并将细胞在含有TGF
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β抑制剂的培养基中培养一时间段以足以产生MSC。
[0010]美国专利申请号US 20170290864提供了在ESCs或iPS细胞通过滋养层细胞的中间分化而发育的条件下将ESCs或iPS细胞分化为MSCs的方法。具体而言，多能干细胞在包含骨形态发生蛋白
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4(BMP
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4)和任选的TGF
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β抑制剂(例如SB431542、A83
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01或ALK5抑制剂)的培养基中培养，并且通过在含有LIF、bFGF、PDGF或其组合的MSC生长培养基中在明胶、玻璃纤维蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、基质胶或胶原涂层皿中培养滋养层细胞，滋养层进一步分化为MSC衍生细胞。
[0011]PCT公开号WO/2011/091475提供了从多能干细胞产生MSCs的方法，所述方法包括
(i)在内源性激活素和TGFβ信号传导抑制剂(例如SB431542)存在下分化附着在培养容器表面的ESC或iPS细胞，和(ii)在MSC培养基存在下传代所得细胞，从而产生MSCs。
[0012]其他
技术介绍
包括美国专利公告号US 10214722和Schubert和Smitz：“人类原始卵泡的体外培养”，在“生育冷冻”中，Ri
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Cheng Chian和Patrick Quinn编辑，剑桥大学出版社出版，联合大学出版社(2020)第200
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212页。

技术实现思路

[0013]根据本专利技术的一些实施例的一个目的，提供一种成分确定的培养基，其包括基础培养基和有效量的敲除血清替代物(KoSR)和ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)，其中所述培养基是无血清的，并且进一步其中所述培养基能够促进多能干细胞(PSCs)分化为间充质干细胞(MSCs)或支持MSCs的扩增。
[0014]根据本专利技术的一些实施例的一个目的，提供一种培养基，包括一基础培养基，所述基础培养基包括DMEM/F12和MEMα，所述DMEM/F12与MEMα的体积比在0.4至2.3之间，其中所述培养基促进多能干细胞(PSCs)分化为间充质干细胞(MSCs)或促进MSCs的增生。
[0015]根据本专利技术的一些实施例的一个目的，提供一种成分确定的培养基，包括一基础培养基，所述基础培养基包括DMEM/F12、浓度至少5％的敲除血清替代物(KoSR)和浓度至少0.5％的ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)，其中所述培养基是无血清的，并且进一步其中所述培养基促进多能干细胞(PSCs)分化为间充质干细胞(MSCs)或促进MSCs的增生。
[0016]根据本专利技术的一些实施例的一个目的，提供一种成分确定的培养基，包括一基础培养基，所述基础培养基包括DMEM/F12、浓度至少为5％的敲除血清替代物(KoSR)、浓度至少为0.5％的ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)以及浓度至少25微克/毫升的L
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抗坏血酸，其中所述培养基不含血清，并且进一步其中所述培养基促进多能干细胞(PSCs)分化为间充质干细胞(MSCs)或促进MSCs的增生。
[0017]根据本专利技术的一些实施例的一个目的，提供一种成分确定的培养基，包括一基础培养基，所述基础培养基包括DMEM HG、浓度至少为5％的敲除血清替代物(KoSR)、浓度至少为0.5％的ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)、浓度至少25微克/毫升的L
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抗坏血酸以及浓度至少为25微克/毫升的丙酮酸钠，其中所述培养基不含血清，并且进一步其中所述培养基促进多能干细胞(PSCs)分化为间充质干细胞(MSCs)或促进MSCs的增生。
[0018]根据本专利技术的一些实施例的一个目的，提供一种培养基，包括一基础培养基，所述基础培养基包括DMEM/F12和MEMα，其中所述DMEM/F12与MEMα的体积比在0.6至1.5之间；浓度至少为3％的基因敲除血清替代物(KoSR)；浓度至少为0.1％的ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)，以及浓度至少为5％的血清，并且其中所述培养基促进多能干细胞(PSCs)分化为间充质干细胞(MSCs)或促进MSCs的增生。
[0019]根据本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种成分确定的培养基，其特征在于：包括一基础培养基和一有效量的敲除血清替代物(KoSR)以及ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)，其中所述培养基是无血清的，并且进一步其中所述培养基促进多能干细胞(PSCs)分化为间充质干细胞(MSCs)或促进MSCs的增生。2.一种培养基，其特征在于：包括一基础培养基，所述基础培养基包括DMEM/F12和MEMα，所述DMEM/F12与MEMα的体积比在0.4至2.3之间，其中所述培养基促进多能干细胞(PSCs)分化为间充质干细胞(MSCs)或促进MSCs的增生。3.如权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述基础培养基包括DMEM/F12。4.如权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述基础培养基包括DMEM高葡萄糖(DMEM HG)。5.如权利要求2所述的培养基，其特征在于：所述DMEM/F12与所述MEMα的所述体积比为DMEM/F12比MEMα在0.6至1.5之间。6.如权利要求2或5所述的培养基，其特征在于：进一步包括敲除血清替代物(KoSR)和ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)中的至少一种。7.如权利要求1、3、4或6中任一项所述的培养基，其特征在于：所述KoSR的浓度为2.5％至15％。8.如权利要求1、3、4、6或7中任一项所述的培养基，其特征在于：所述ITS的浓度为0.1％至3％。9.如权利要求1、3或7
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8中任一项所述的培养基，其特征在于：进一步包括葡萄糖、L
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抗坏血酸和丙酮酸钠中的至少一种。10.如权利要求9所述的培养基，其特征在于：所述葡萄糖的浓度为1克/升至5克/升。11.如权利要求9所述的培养基，其特征在于：所述L
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抗坏血酸的浓度为20微克/毫升至200微克/毫升。12.如权利要求9所述的培养基，其特征在于：所述丙酮酸钠的浓度为20微克/毫升至200微克/毫升。13.如权利要求2、5或6
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8中任一项所述的培养基，其特征在于：进一步包括血清。14.如权利要求13所述的培养基，其特征在于：所述血清的浓度为3％至30％。15.如权利要求1至14中任一项所述的培养基，其特征在于：进一步包括碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)。16.如权利要求15所述的培养基，其特征在于：所述bFGF包括FGF2或FGF4。17.如权利要求15所述的培养基，其特征在于：所述bFGF包括FGF2及FGF4。18.如权利要求16至17中任一项所述的培养基，其特征在于：所述FGF2的浓度为1纳克/毫升至100纳克/毫升。19.如权利要求16至17中任一项所述的培养基，其特征在于：所述FGF4的浓度为1纳克/毫升至100纳克/毫升。20.如权利要求1至19中任一项所述的培养基，其特征在于：进一步包括血小板衍生生长因子(PDGF)、转化生长因子β(TGFβ)、表皮生长因子(EGF)和WNT
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3a中的至少一种。21.如权利要求15所述的培养基，其特征在于：所述PDGF包括PDGF
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BB。22.如权利要求20至21中任一项所述的培养基，其特征在于：所述PDGF浓度为5纳克/毫升至100纳克/毫升。
23.如权利要求20所述的培养基，其特征在于：所述TGFβ包括TGFβ1或TGFβ3。24.如权利要求20或23任一项所述的培养基，其特征在于：所述TGFβ的浓度为5纳克/毫升至50纳克/毫升。25.如权利要求20所述的培养基，其特征在于：所述EGF的浓度为1纳克/毫升至100纳克/毫升。26.如权利要求20所述的培养基，其特征在于：所述WNT
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3a的浓度为10纳克/毫升至200纳克/毫升。27.一种成分确定的培养基，其特征在于：包括一基础培养基，所述基础培养基包括DMEM/F12、浓度至少5％的敲除血清替代物(KoSR)和浓度至少0.5％的ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)，其中所述培养基是无血清的，并且进一步其中所述培养基促进多能干细胞(PSCs)分化为间充质干细胞(MSCs)或促进MSCs的增生。28.一种培养基，其特征在于：包括一基础培养基，所述基础培养基包括DMEM/F12和MEMα，其中所述DMEM/F12与MEMα的体积比在0.6至1.5之间；浓度至少为3％的基因敲除血清替代物(KoSR)；浓度至少为0.1％的ITS(胰岛素、转铁蛋白和硒)，以及浓度至少为5％...

【专利技术属性】
技术研发人员：迈克尔，
申请(专利权)人：阿塞尔塔有限公司，
类型：发明
国别省市：