一种新型小鼠滋养层干细胞的构建方法技术

本发明专利技术公开了一种新型小鼠滋养层干细胞的构建方法，通过筛选化合物诱导剂组合，首次从16

【技术实现步骤摘要】
一种新型小鼠滋养层干细胞的构建方法


[0001]本专利技术涉及小鼠干细胞
，具体的说是一种新型小鼠滋养层干细胞的构建方法。

技术介绍

[0002]胚胎滋养层对于胚胎植入母体和维持胚胎的正常发育至关重要。哺乳动物胚胎在第一次谱系分化过程中首先产生了滋养外胚层（TE）和内细胞团（ICM），这一过程发生在16
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32细胞阶段。在囊胚后期，内细胞团又分化为外胚层(EPI)和原始内胚层(PE)。外胚层(EPI)发育为胎儿个体，原始内胚层(PE)形成卵黄囊，而滋养外胚层（TE）主要参与胚胎着床并发育为胎膜和胎盘。胎盘作为妊娠期胎儿与母体进行营养物质和气体交换的场所，是哺乳动物妊娠期内非常重要内分泌器官。在生殖医学领域，虽然辅助生殖技术的应用帮助众多不孕不育夫妇实现了为人父母的愿望，但胚胎着床失败仍是解决不孕症的难题。在科学研究中，由于人源胚胎材料稀缺和相关伦理的约束，小鼠胚胎滋养层干细胞成为了一种重要的滋养外胚层体外研究模型，对于研究胚胎早期分化、胚胎着床以及胎盘发育等都具有重要应用价值。同时，滋养层干细胞的深入研究对于干预和治疗胚胎着床失败，反复流产以及胎盘异常等临床疾病具有重要的指导意义。
[0003]目前传统小鼠胚胎滋养层干细胞的构建是以囊胚或者早期胎盘为起始材料，构建周期长、效率较低。同时在传统构建体系中，胚胎体外衍生的细胞群中除了滋养层干细胞（CDX2为标志蛋白）外，还包含大量的原始内胚层样细胞（GATA6 为标志蛋白）和分化后的滋养层巨细胞等，是一种混合生长的状态，需要较长的时间去纯化才能完成滋养层干细胞的建系。因此，需要建立更加简单且高效的小鼠滋养层干细胞构建体系。

技术实现思路

[0004]为了弥补以上不足，本专利技术提供了一种新型小鼠滋养层干细胞的构建方法，以解决上述
技术介绍
中的问题。
[0005]本专利技术的技术方案是：
[0006]一种新型小鼠滋养层干细胞的构建方法，包括下列步骤：
[0007]1）ICR小鼠胚胎成纤维细胞经10ug/ml浓度的丝裂霉素处理3小时，作为饲养层细胞备用；
[0008]2）配制小鼠滋养层干细胞诱导培养基，将RPMI
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1640基础培养基+20%的胎牛血清，然后分别加入丙酮酸钠、L
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谷氨酰胺、β
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巯基乙醇、重组人成纤维细胞生长因子
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4、肝素、XAV939、LATS
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IN
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1、Y27632、重组人骨形态发生蛋白
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4、重组人激活素
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A与霉素混合溶液；
[0009]3）收集16～32细胞阶段C57BL/6J小鼠胚胎、E3.5囊胚与E4.5囊胚其中一种，用酸性台氏液去除透明带；
[0010]4）去除透明带后放入底部铺好饲养层细胞的孔板中，每孔放入1枚；
[0011]5）胚胎衍生物贴附在皿底的饲养层细胞上，向外缘延伸生长；
[0012]6）培养5天后，将衍生物在胰酶溶液中消化5分钟，用玻璃细针轻轻撕碎并进行传代培养；
[0013]7）传代培养2～4天后，挑选滋养层干细胞单克隆扩大培养，即可获得纯化的滋养层干细胞系；
[0014]8）上述培养过程中，每48小时更换一次小鼠滋养层干细胞诱导培养基。
[0015]作为优选的技术方案，所述3）中收集16～32细胞阶段C57BL/6J小鼠胚胎，用酸性台氏液去除透明带；所述5）中16～32细胞期胚胎会在0.5～1天后贴附在皿底的饲养层细胞上，以扁平的克隆形态向外缘延伸生长。
[0016]作为优选的技术方案，所述2）中加入丙酮酸钠 11g/L, L
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谷氨酰胺2mM/L,β
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巯基乙醇 0.1 nM/L，重组人成纤维细胞生长因子
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425ng/ml，肝素 1μg/ml, XAV939 3μM/L，LATS
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IN
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1 2μM/L，Y27632 10μM/L, 重组人骨形态发生蛋白
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4 10ng/ml, 重组人激活素
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A 20 ng/ml,1%的霉素混合溶液。在现有培养基上加入了XAV939、LATS
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IN
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1、Y27632、重组人骨形态发生蛋白
‑
4、重组人激活素
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A 等多种小分子化合物抑制剂，对Hippo、Wnt 、RHO
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ROCK等信号通路进行多维度调控，高效诱导TE的产生，抑制ICM的产生和进一步的谱系分化，达到了对早期16
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32阶段的卵裂胚胎进行高效稳定的诱导。
[0017]作为优选的技术方案，霉素混合溶液为青霉素与链霉素的混合溶液。
[0018]作为优选的技术方案，所述7）传代培养3天后，挑选滋养层干细胞单克隆扩大培养，即可获得纯化的滋养层干细胞系。
[0019]作为优选的技术方案，所述6）中胰酶溶液为0.05%浓度的胰酶溶液。
[0020]由于采用了上述技术方案一种新型小鼠滋养层干细胞的构建方法，包括下列步骤：
[0021]1）ICR小鼠胚胎成纤维细胞经10ug/ml浓度的丝裂霉素处理3小时，作为饲养层细胞备用；2）配制小鼠滋养层干细胞诱导培养基，将RPMI
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1640基础培养基+20%的胎牛血清，然后分别加入丙酮酸钠、L
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谷氨酰胺、β
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巯基乙醇、重组人成纤维细胞生长因子
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4、肝素、XAV939、LATS
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IN
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1、Y27632、重组人骨形态发生蛋白
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4、重组人激活素
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A与霉素混合溶液；3）收集16～32细胞阶段C57BL/6J小鼠胚胎、E3.5囊胚与E4.5囊胚其中一种，用酸性台氏液去除透明带；4）胚胎去除透明带后放入底部铺好饲养层细胞的孔板中，每孔放入1枚；5）胚胎衍生物贴附在皿底的饲养层细胞上，向外缘延伸生长；6）培养5天后，将衍生物在胰酶溶液中消化5分钟，用玻璃细针轻轻撕碎并进行传代培养；7）传代培养2～4天后，挑选滋养层干细胞单克隆扩大培养，即可获得纯化的滋养层干细胞系；8）上述培养过程中，每48小时更换一次小鼠滋养层干细胞诱导培养基。
[0022]本专利技术与现有技术相比较的优点：
[0023]1.该诱导培养体系，不仅支持更早期的16
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32细胞期胚胎，也支持E3.5和E4.5囊胚，滋养层干细胞衍生效率高，结果稳定。与传统诱导培养体系相比，该诱导体系针对上述不同阶段胚胎的构建成功率均显著提高，其中16细胞期胚胎为96.00% VS 41.67%; 32细胞期胚胎为97.22% VS 46.67%; E3.5囊胚为100.00% VS 64%; E4.5囊胚为91.67% VS 64.29%。
[0024本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种新型小鼠滋养层干细胞的构建方法，其特征在于，包括下列步骤：1）ICR小鼠胚胎成纤维细胞经10ug/ml浓度的丝裂霉素处理3小时，作为饲养层细胞备用；2）配制小鼠滋养层干细胞诱导培养基，将RPMI
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1640基础培养基+20%的胎牛血清，然后分别加入丙酮酸钠、L
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谷氨酰胺、β
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巯基乙醇、重组人成纤维细胞生长因子
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4、肝素、XAV939、LATS
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IN
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1、Y27632、重组人骨形态发生蛋白
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4、重组人激活素
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A与霉素混合溶液；3）收集16～32细胞阶段C57BL/6J小鼠胚胎、E3.5囊胚与E4.5囊胚其中一种，用酸性台氏液去除透明带；4）胚胎去除透明带后放入底部铺好饲养层细胞的孔板中，每孔放入1枚；5）胚胎衍生物贴附在皿底的饲养层细胞上，向外缘延伸生长；6）培养5天后，将衍生物在胰酶溶液中消化5分钟，用玻璃细针轻轻撕碎并进行传代培养；7）传代培养2～4天后，挑选滋养层干细胞单克隆扩大培养，即可获得纯化的滋养层干细胞系；8）上述培养过程中，每48小时更换一次小鼠滋养层干细胞诱导培养基。2.如权利要求1所述的一种新型小鼠滋养层干细胞的构建方法，其特征在于：所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：高亚可，张建，郭威，
申请(专利权)人：武汉儿童医院，
类型：发明
国别省市：