猪潜能扩展干细胞培养基及其培育方法技术

本发明专利技术公开了一种建立猪潜能扩展干细胞（pEPSC）的培养基及其培育方法，所述培养基的配方为：DMEM/F

【技术实现步骤摘要】
猪潜能扩展干细胞培养基及其培育方法


[0001]本专利技术属于动物细胞培养
，具体涉及潜能扩展干细胞培养基及其培育方法。

技术介绍

[0002]虽然小鼠胚胎干细胞培育技术手段已非常成熟，但是在将近20多年的研究中，研究者们始终没有获得类似小鼠的具有真正全能性的猪胚胎干细胞系（pES）[1, 2]。大多数研究人员发现在通过各种培养手段和体内分离培养出的猪pES细胞系很难维持胚胎干细胞（ES）样状态，pES细胞高表达Nanog、Rex1和TDGF1等直接参与向外胚层干细胞分化的细胞因子，也就是说pES细胞表现出强烈的分化成外胚层ES样状态的趋势[3
‑
5]。甚至Sox2、bFGF、FG
·
FR1、FGFR2等仅在猪外胚层细胞中表达的细胞因子也在分离培养的pES细胞系中表达[6
‑
8]。究其原因，主要是因为并不能确定可以维持猪胚胎干细胞多能性状态的培养液和细胞信号通路。研究者们针对于这两个主要因素，仿照其他哺乳动物胚胎干细胞建系的成功研究做了一系列的尝试，目前却只能获得具有一定多能性的“猪外胚层样胚胎干细胞系（EpiSC
‑
like pESCs）”[5, 9, 10]。
[0003]除了用传统的方法从内细胞团分离培养ES细胞，近年来，诱导多能干细胞（iPS）技术也被应用到建立pES细胞系中来，但是截至目前，利用iPS技术建立起来的piPS细胞系都显示出启动多能性状态，具有扁平的形态和FGF以及许多与mEpiSCs类似的特征，并且piPS细胞系在形态学、AP活性、信号通路的激活和多能标记物的表达等方面与EpiSC
‑
like pESCs细胞系非常相似，也就是说piPSC类似于“EpiSC
‑
like pESCs”[8, 9, 11]。并且迄今为止，也没有获得嵌合体的成功案例。
[0004]猪潜能扩展干细胞（EPSCs）比目前的干细胞系具有更大的分化、扩增潜力，它们具有发育胚胎中第一细胞的特征，并且可以发育成任何类型的细胞[12]。其获取阶段在受精卵还只分裂为4或8个细胞时期，这些细胞比从内细胞团发育阶段分离获取的ES细胞更少进入分化进程，实验数据显示其全能性更高，能生成ESCs、EpiSCs等所有的干细胞类型，甚至是滋养层干细胞。其通过靶向调节着床前小鼠胚胎谱系分化的关键分子通路，具有广泛胚外和胚胎谱系分化倾向的扩增潜能干细胞可以成功地衍生出[9, 12]。大量的研究已经确定了丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）通路、Src通路、Hippo通路和核糖基化多聚ADP（PARP）细胞因子在胚胎干细胞分化中的主要作用[10, 13]。特别是Src阻断剂部分阻断了桑葚胚的发育，影响了胚泡中的滋养外胚层和原始内胚层的分化[14]。基因Parp1/2和tankyrase 1/2(Tnks/ Tnks2) 的表达降低分别导致胚胎干细胞的分化和滋养层的分化，而敲除Parg基因会直接影响PARP水解能力，从而导致滋养层干细胞分化能力和滋养外胚层的缺失[15]。另外，Wnt信号在脊椎动物和滋养细胞的早期发育中也起着重要作用。重要的是，通过Hippo通路的关键效应因子Yap1，Wnt和MAPK通路之间存在信号交叉，从而影响胚胎的分化[12, 16]。
[0005]尽管现有技术对猪潜能扩展干细胞进行了大量的理论和实验研究，但尚未建立稳
定的猪潜能扩展干细胞培育体系。

技术实现思路

[0006]针对上述存在的技术不足，本专利技术提供了潜能扩展干细胞培养基及其培育方法，具体通过如下技术方案实现：一种用于猪潜能扩展干细胞的培养基，其包括以下成分：DMEM/F
‑
12培养基，KSR，MEM NEAA，谷氨酰胺
‑
青霉素
‑
链霉素，β
‑
巯基乙醇，人LIF蛋白，PD0325901，CHIR99021，JNK抑制剂VIII，SB203580和XAV939。
[0007]优选地，所述培养基包括以下成分：DMEM/F
‑
12培养基作为基础培养基；基础培养基终体积20%的KSR，1
×ꢀ
(vol/vol)的MEM NEAA，1
×
(vol/vol)的谷氨酰胺
‑
青霉素
‑
链霉素，0.1 mM终浓度的β
‑
巯基乙醇，10
3 U人LIF蛋白，1.0 μM终浓度的PD0325901，3.0 μM终浓度的CHIR99021，4.0 μM终浓度的JNK抑制剂VIII，10.0 μM终浓度的SB203580，5.0 μM终浓度的XAV939。通过该优选的培养基配方，可以培养得到并维持稳定的猪潜能扩展干细胞体系。
[0008]本专利技术还提供了建立猪潜能扩展干细胞的培育方法，包括以下步骤：将猪8
‑
细胞胚胎加入本专利技术所述培养基中进行培养，经培养、传代和扩增得到猪潜能扩展干细胞。
[0009]优选地，所述方法包括以下步骤：从猪受精胚胎获取猪8
‑
细胞胚胎，分别移入96孔SNL给料板或凝胶化板的孔中，加入本专利技术所述培养基，培养所述8
‑
细胞胚胎直到孵化并形成衍生物，将其分离或用口吸管将其机械切成小片，转移到新的96孔SNL给料板或凝胶化板中，继续培养至细胞群落达到80
‑
90%密度，将细胞传代至24孔SNL给料板或凝胶化板中，扩增至6孔板，将所得猪潜能扩展干细胞冷冻于胚胎冷冻液，保存于液氮中。通过该优选的培育方法，可以培养得到并维持稳定的猪潜能扩展干细胞体系。
[0010]本专利技术还提供了通过本专利技术所述培育方法得到的猪潜能扩展干细胞。
[0011]本专利技术成功建立了高表达OCT4、SOX2、NANOG的稳定猪EPSC细胞。
附图说明
[0012]为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1显示了使用本专利技术培养基培育猪胚胎的结果对比图。其中左图为使用普通培养基培养10天时的胚胎发育情况，右图为使用本专利技术培养基培养10天时成功筛选到的pEPSC克隆。
[0013]图2显示了通过免疫荧光染色检测EPSC关键因子OCT4、SOX2、NANOG表达水平的图。结果显示，EPSC中OCT4、SOX2、NANOG均高表达。
具体实施方式
[0014]以下结合具体实施方式对本专利技术进行更为详细的描述，这些描述仅仅是为了例证性说明本专利技术的技术方案，并非对本专利技术的保护范围进行任何方式的限制。在不脱离本专利技术基本原理和精神的前提下，本领域技术人员可以对本专利技术的某些具体方案、技术特征、参数等进行各种修改、替换和调整，仍落在本专利技术的保护范围之内。
Pluripotent Stem Cells with In Vivo Embryonic and Extraembryonic Potency. Cell. 2017;169(2):本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于猪潜能扩展干细胞的培养基，其特征在于：所述培养基包括以下成分：DMEM/F
‑
12培养基，KSR，MEM NEAA，谷氨酰胺
‑
青霉素
‑
链霉素，β
‑
巯基乙醇，人LIF蛋白，PD0325901，CHIR99021，JNK抑制剂VIII，SB203580和XAV939。2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于：所述培养基包括以下成分：DMEM/F
‑
12培养基作为基础培养基；基础培养基终体积20%的KSR，1
×ꢀ
(vol/vol)的MEM NEAA，1
×
(vol/vol)的谷氨酰胺
‑
青霉素
‑
链霉素，0.1 mM终浓度的β
‑
巯基乙醇，10
3 U人LIF蛋白，1.0 μM终浓度的PD0325901，3.0 μM终浓度...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁浩，葛良鹏，丁玉春，孙静，
申请(专利权)人：重庆市畜牧科学院，
类型：发明
国别省市：