多能细胞的未分化维持培养用组合物、多能细胞的未分化维持培养用培养基、多能细胞的未分化状态下的维持培养方法、和多能细胞的制造方法技术

提供一种多能细胞的未分化维持培养用组合物以及使用其的培养方法，所述未分化维持培养用组合物在多能细胞的未分化状态下的维持培养中，能够提高所述多能细胞的增殖率、或者能够降低所述多能细胞的细胞死亡频率。本发明专利技术的多能细胞的未分化维持培养用组合物包含微小气泡。小气泡。小气泡。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】多能细胞的未分化维持培养用组合物、多能细胞的未分化维持培养用培养基、多能细胞的未分化状态下的维持培养方法、和多能细胞的制造方法


[0001]本专利技术涉及多能细胞的未分化维持培养用组合物、多能细胞的未分化维持培养用培养基、多能细胞的未分化状态下的维持培养方法、和多能细胞的制造方法。

技术介绍

[0002]在再生医疗中，尝试着由具有多能性的细胞(多能细胞)向目标细胞进行分化诱导(非专利文献1)，使用得到的细胞或细胞集团(治疗用细胞)进行治疗。
[0003]现有技术文献
[0004]非专利文献
[0005]非专利文献1：Hyunjin Choi等、《多能性幹細胞
の
大量培養法
の
現状：透析浮遊培養
を
用
いたヒト
iPS細胞
の
分化誘導》(多能干细胞的大量培养方法的现状：使用了透析悬浮培养的人iPS细胞的分化诱导)2019、Organ Biology、VOL.26、NO.2、85～94页

技术实现思路

[0006]专利技术要解决的问题
[0007]将所述治疗用细胞适用于人的治疗的情况下，需要大量的多能细胞。所述多能细胞具有自我复制能力，因此能够通过在未分化状态下进行维持培养而增加所述多能细胞的数目。因此，研究了通过抑制所述多能细胞的分化能力，在未分化状态下对所述多能细胞进行维持培养的方法。
[0008]因此，期望能够维持所述多能细胞的未分化状态并且更加效率良好地使所述多能细胞增殖的方法。
[0009]因此，本专利技术的目的在于提供在，多能细胞的未分化状态下的维持培养中，能够提高所述多能细胞的增殖率、或能够降低所述多能细胞的细胞死亡的频率的多能细胞的未分化维持培养用组合物，以及使用了该未分化维持培养用组合物的培养方法。
[0010]用于解决问题的方案
[0011]为了达成所述目的，本专利技术的多能细胞的未分化维持培养用组合物(以下称为“维持组合物”)包含微小气泡。
[0012]本专利技术的多能细胞的未分化维持培养用培养基(以下，也称为“维持培养基”)包含本专利技术的多能细胞的未分化维持培养用组合物。
[0013]本专利技术的多能细胞的未分化状态下的维持培养方法(以下，称为“维持培养方法”)包括在微小气泡的存在下在未分化状态下对多能细胞进行维持培养的维持培养工序。
[0014]本专利技术的多能细胞的制造方法(以下称为“制造方法”)包括通过对多能细胞在未分化状态下进行维持培养，从而制造多能细胞的制造工序，
[0015]所述制造工序通过所述本专利技术的多能细胞的未分化状态下的维持培养方法来实
施。
[0016]专利技术的效果
[0017]通过本专利技术，与实质上不包含微小气泡的、多能细胞的未分化维持培养用组合物相比较，能够提高所述多能细胞的增殖率、或能够降低所述多能细胞的细胞死亡的频率。
附图说明
[0018]图1是示出实施例1中的维持组合物的制造装置的示意图。
[0019]图2是表示实施例1中的维持培养的流程的图。
[0020]图3是表示实施例1中的线粒体活性的相对值(存活率)的图。
[0021]图4是表示实施例1中的细胞数的相对值的图。
[0022]图5是表示实施例1中的碱性磷酸酶染色的结果的照片。
[0023]图6是表示实施例1中的利用抗TRA
‑1‑
60抗体的染色结果的图。
[0024]图7是表示实施例1中的利用抗SSEA
‑
4抗体的染色结果的图。
具体实施方式
[0025]＜未分化维持培养用组合物＞
[0026]本专利技术的多能细胞的未分化维持培养用组合物如前所述包含微小气泡。本专利技术的维持组合物的特征在于包含微小气泡，对其他构成和条件没有特别的限制。通过本专利技术的维持组合物，能够在维持未分化状态的状态下对多能细胞进行维持培养。
[0027]本专利技术人等进行深入研究的结果发现，通过使微小气泡共存，在所述多能细胞的维持培养中，能够提高所述多能细胞的增殖率、或能够降低所述多能细胞的细胞死亡的频率，从而确立了本专利技术。通过本专利技术，在所述多能细胞的维持培养中，由于能够提高所述多能细胞的增殖率或者能够降低所述多能细胞的细胞死亡的频率，因此与多能细胞的未分化维持培养用组合物进行比较，能够更加效率良好地在维持未分化状态的状态下对多能细胞进行维持培养。
[0028]本专利技术中，“多能性”是指具有向例如包含内胚层、中胚层和外胚层的三胚层的分化能力。另外，本专利技术中，“多能性”也包含例如具有向所有细胞的分化能力、即具有全能性。对于所述多能细胞，没有特别的限定，可列举出例如胚胎干细胞(Embryonic Stem cell：ES细胞)、诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells：iPS细胞)、核移植ES细胞(ntES细胞)、生殖性干细胞、体性干细胞、胚性肿瘤细胞等，优选为iPS细胞。对于所述多能细胞的来源，没有特别的限定，可列举出例如人和除了人以外的非人动物。所述非人动物可列举出例如猴子、大猩猩、黑猩猩、绒猴等灵长类；小鼠、大鼠、狗、兔子、绵羊、马、豚鼠等。
[0029]本专利技术中，“分化能力”是指例如在使其分化为目标的分化细胞的条件下对所述多能细胞进行培养时，所述多能细胞的一部分或全部能够分化成所述目标的分化细胞。
[0030]本专利技术中，“未分化”是指例如在培养的前后分化能力没有变化、或多能细胞没有分化。
[0031]本专利技术中“多能细胞的未分化维持”是指例如在没有分化状态下维持多能细胞。具体而言，“多能细胞的未分化维持”是指例如保持了所述多能细胞所具有的分化能力的状态，即，维持向三胚层的分化能力的状态。所述多能细胞是否维持未分化状态可以通过例如
对对象的多能细胞进行维持培养，利用得到的细胞中的细胞表面标记物等标记物评价。作为具体例，所述多能细胞为iPS细胞的情况下，所述细胞表面标记物可列举出阶段特异胚抗原
‑
4(SSEA
‑
4)、TRA
‑1‑
60等。TRA
‑1‑
60为例如局部存在于细胞表面的足细胞标志蛋白(糖蛋白)上的硫酸角蛋白(糖链)。因此，在所述维持培养后的细胞中，SSEA
‑
4或TRA
‑1‑
60表达的情况下，即，SSEA
‑
4或TRA
‑1‑
60为阳性的情况下，所述多能细胞能够评价为例如在所述维持培养后维持了未分化状态。另一方面，在所述维持培养后的细胞中，在SSEA
‑
4和TRA
‑1‑
60没有表达的情况下，即，SSEA
‑
4和TRA
‑1‑
60为阴性的情况下，所述多能细胞能够评价为例如在所述维持培养后没有维持未分化状态。所述细胞表面标记物的表达根据后述的实施例1，能够通过流式细胞仪进本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种多能细胞的未分化维持培养用组合物，其包含微小气泡。2.根据权利要求1所述的未分化维持培养用组合物，其中，所述微小气泡包含选自由氢气(H2)、一氧化氮(NO)、一氧化二氮(N2O)、一氧化碳(CO)、二氧化碳(CO2)、硫化氢(H2S)、氧气(O2)、臭氧(O3)、氦气(He)、氩气(Ar)、氪气(Kr)、氙气(Xe)、氮气(N2)、空气、甲烷(CH4)、乙烷(CH3CH3)、丙烷(CH3CH2CH3)、氟甲烷(CH3F)、二氟甲烷(CH2F2)、四氟化碳(CF4)、和环氧乙烷(C2H4O)组成的组中的至少一种作为气体成分。3.根据权利要求1或2所述的未分化维持培养用组合物，其中，所述微小气泡包含氧气作为气体成分。4.根据权利要求1～3中任一项所述的未分化维持培养用组合物，其中，所述微小气泡的密度为5
×
105～5
×
10
12
个/ml。5.根据权利要求1～4中任一项所述的未分化维持培养用组合物，其还包含介质，所述介质为液体和固体中的至少一者。6.根据权利要求1～5中任一项所述的未分化维持培养用组合物，其中，所述多能细胞为胚胎干细胞(ES细胞)或诱导多能干细胞(iPS细胞)。7.一种多能细胞的未分化维持培养用培养基，其包含权利要求1～6中任一项所述的多能细胞的未分化维持培养用组合物。8.一...

【专利技术属性】
技术研发人员：畑山直之，内藤宗和，平井宗一，福重香，大山俊治，
申请(专利权)人：住友精化株式会社，
类型：发明
国别省市：