本发明专利技术公开了一种以mTOR、SMAD信号通路和p53基因为靶点在提高鸡PGCs体外建系效率中的应用，属于鸡原始生殖细胞体外建系技术领域，本发明专利技术发现mTOR、SMAD信号通路和p53基因与鸡PGCs体外建系效率相关，并以此为基础开发了组合物，可以显著提高鸡PGCs的体外建系效率。可以显著提高鸡PGCs的体外建系效率。可以显著提高鸡PGCs的体外建系效率。
【技术实现步骤摘要】
以mTOR、SMAD信号通路和p53基因为靶点在提高鸡PGCs体外建系效率中的应用
[0001]本专利技术涉及鸡原始生殖细胞体外建系
，更具体地说是涉及以mTOR、SMAD信号通路和p53基因为靶点在提高鸡PGCs体外建系效率中的应用。
技术介绍
[0002]不同于哺乳动物利用体细胞核移植技术和胚胎移植技术获得基因修饰动物，原始生殖细胞(Primordial Germ Cells，PGCs)是目前家禽中最理想的可以结合CRISPR/Cas9开展基因组编辑的技术，并有望成为通用的家禽离体保种技术。
[0003]PGCs是精原细胞和卵原细胞的祖先细胞，可以将遗传物质传递给下一代。在以鸡PGCs为载体进行基因操作过程中面临一些难题，如主流的培养体系
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有饲养层、有血清和条件培养基，该体系下PGCs体外建系难度大，总体建系成功率4～25％，大部分文献报道在10％左右，阻碍了鸡遗传修饰技术的发展。
[0004]近年来，随着对PGCs调控机制研究的加深，鸡PGCs体外培养体系得到了进一步优化。bFGF通过激活MEK/ERK信号通路来促进鸡PGCs的体外扩增。最新研究表明FGF、Insulin和SMAD信号通路可以维持禽类PGCs体外自我更新，在主流培养体系
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有饲养层有血清培养基上添加生长因子ActivinA，并用胰岛素或IGF
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1代替生长因子SCF，分离的26枚雄性鸡胚中有8枚建系成功，雄性成功率为31％。同时，他们提出了以生长因子FGF2、ActivinA和胰岛素为核心的无饲养层无血清培养体系，显著提高了鸡PGCs的体外建系效率，雄性建系成功率最高为61％。但在该培养体系并不是主流培养体系，用到的试剂十多种，配置非常复杂且不稳定，在不同实验室结果差异大，对细胞培养人员要求高，而且该体系下进行的基因操作，获得供体鸡后代的效率也很低，而用于分离鸭PGCs进行体外培养只能维持1个月。
[0005]因此，发现与鸡PGCs体外建系相关的信号通路和基因，并以mTOR、SMAD信号通路和p53基因为靶点提高鸡PGCs体外建系效率是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
[0006]有鉴于此，本专利技术发现mTOR、SMAD信号通路和p53基因与鸡PGCs体外建系效率相关，并以此为基础开发了组合物，可以显著提高鸡PGCs的体外建系效率。
[0007]为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：
[0008]以mTOR、SMAD信号通路和p53基因为靶点在提高鸡PGCs体外建系效率中的应用。
[0009]作为与上述技术方案相同的专利技术构思，本专利技术还请求保护一种同时促进mTOR、SMAD信号通路表达，且抑制p53基因表达的组合物在提高鸡PGCs体外建系效率中的应用。
[0010]作为与上述技术方案相同的专利技术构思，本专利技术还请求保护一种提高鸡PGCs体外建系效率的组合物，包括：基础培养液、XAV
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939、Y
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27632、ActivinA、SF1670、白藜芦醇和p53
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Snail抑制剂。
[0011]优选地，各组分的终浓度分别为XAV
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93910μM、Y
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276325μM、ActivinA20ng/μL、
SF16705μM、白藜芦醇15μM、p53
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Snail结合抑制剂5μM。
[0012]优选地，所述基础培养液包括：50％KO
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DMEM、36％BRL条件培养液、7.5％胎牛血清、2.5％鸡血清、1％非必需氨基酸、1％GlutaMAXTM、1％青霉素和链霉素、0.1mmol/Lβ
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巯基乙醇、8ng/μL重组人碱性成纤维细胞生长因子、12ng/μL人干细胞因子。
[0013]经由上述的技术方案可知，与现有技术(分离和维持小鼠滋养层干细胞的培养体系中含有20ng/ml Activin A、10nM XAV939和5nM Y27632)相比，本专利技术发现，含有20ng/ml ActivinA、5μM XAV939和5μM Y27632的培养体系可以显著提高鸡PGCs体外扩增效率，成功建系平均时间由29天降低到23天，但其建系成功率没有显著变化。又因，白藜芦醇是一种天然多酚小分子化合物，可以提高体细胞重编程为iPSC的效率，还可以降低作用于乙酰化底物和NAD+的SIRT1的Michaelis常数，通过促进SIRT1依赖性的p53脱乙酰作用增加细胞存活。p53基因的敲除或抑制，可以显著提高小鼠单倍体胚胎干细胞的建系效率。肿瘤抑制因子Pten的缺失可以维持胚胎干细胞的多能性并调节分化，而Pten抑制剂SF1670有助于胚胎干细胞多能性的维持。PGCs体外建系的过程是PGCs在维持多能性的同时获得了几乎无限的增殖能力，即自我更新。因此，在上述培养体系中添加5μMp53抑制剂、5μM SF1670和15μM白藜芦醇，建系所需时间最短、建系成功率最高，成功建系平均时间由23天降低到15天，雄性PGCs建系成功率由25％提高到57％以上。其机理可能是SF1670通过抑制Pten增强了mTOR等因子活性，白藜芦醇和p53抑制剂共同作用于p53基因，它们联合使用提高了鸡PGCs的建系效率。
附图说明
[0014]为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
[0015]图1附图为不同培养体系分离培养鸡PGCs形态观察图；A，建系不成功的B组PGCs体外培养7天后死亡；B，建系成功的B组PGCs体外培养7天的形态；C，建系成功的C组PGCs体外培养7天的形态；D，建系成功的C组PGCs体外培养15天的形态，黄色细箭头代表透明状且变大的PGCs，红色粗箭头代表边缘破裂并结团的PGCs，A、B、C图标尺为50μm,D图标尺为100μm；
[0016]图2附图为将荧光标记的PGCs转化至受体鸡中，分离鸡胚性腺的观察结果和PCR结果图；A为免疫荧光法观察C组的PGCs检测到生殖细胞表面标志蛋白SSEA
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1的表达；B为PCR结果显示，建系成功的鸡PGCs均为雄性；C为红色标记PGCs注射到2.5胚龄鸡胚，继续孵化6天后分离性腺观察到PGCs可以在体内继续发育。
具体实施方式
[0017]下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0018]本专利技术实施例记载了不同的组合物对于鸡PGCs体外建系的影响，其本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.以mTOR、SMAD信号通路和p53基因为靶点在提高鸡PGCs体外建系效率中的应用。2.一种同时促进mTOR、SMAD信号通路表达，且抑制p53基因表达的组合物在提高鸡PGCs体外建系效率中的应用。3.一种提高鸡PGCs体外建系效率的组合物，其特征在于，包括：基础培养液、XAV
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939、Y
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27632、ActivinA、SF1670、白藜芦醇和p53
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Snail抑制剂。4.根据权利要求3所述的一种提高鸡PGCs体外建系效率的组合物，其特征在于，各组分的终浓度分别为XAV
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93910...
【专利技术属性】
技术研发人员：邹娴，罗成龙，舒鼎铭，何燕华，陈鹏，计坚，李晓娇，
申请(专利权)人：广东省农业科学院动物科学研究所，
类型：发明
国别省市：
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