一种用于悬浮培养条件下诱导肝细胞分化成熟的诱导培养基以及方法技术

本发明专利技术公开了一种用于悬浮培养条件下诱导肝细胞分化成熟的诱导培养基以及方法，涉及细胞培养技术领域。本发明专利技术是在悬浮培养条件下，通过在肝细胞培养基中添加Notch信号通路阻断剂、TGF

【技术实现步骤摘要】
一种用于悬浮培养条件下诱导肝细胞分化成熟的诱导培养基以及方法


[0001]本专利技术涉及细胞培养
，具体而言，涉及一种用于悬浮培养条件下诱导肝细胞分化成熟的诱导培养基以及方法。

技术介绍

[0002]目前，治疗终末期肝功能衰竭唯一的有效方法是原位肝脏移植，但是供体肝脏严重稀缺，难以满足巨大且急迫的临床需求。而大部分等待肝移植的重症肝病患者得不到及时的肝移植治疗，而排在肝移植等待名单上的患者仍以每年11％的速度快速增加，每年有大量的患者(约17％)在等待肝移植的过程中不幸死亡。
[0003]近年来，以肝细胞移植和生物人工肝为代表的肝细胞替代治疗，成为终末期重症肝病治疗研究的热点，并已在临床前研究以及小规模的临床试验中取得了较好的治疗效果。然而，人源肝细胞的长期培养和规模化制备在技术上仍然存在诸多困难，尚难以大量获取功能成熟的肝细胞，限制了这两种肝细胞治疗方法的广泛应用。近年来，干细胞技术的快速发展为功能性肝细胞的获取提供了全新的细胞来源，也为各种原因导致的终末期肝病的治疗开辟了新的路径。
[0004]目前，细胞规模化生产方法主要包括以“细胞工厂”为代表的平皿培养法，以及基于微载体的生物反应器悬浮培养法。其中平皿培养法仍面临培养面积有限、细胞产品批次生产数量有限、批次间质量不稳定，生产过程操作繁琐、人工成本较高等问题，仅能满足于中小规模的细胞生产需求。而生物反应器悬浮培养法生产细胞，其操作相对更简便，且可根据不同的细胞产量需求，灵活选择小规模(0.1
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0.5mL)、中试规模(1<br/>‑
5L)和生产规模(10L)的生物反应器，进行细胞规模化制备。
[0005]利用生物反应器规模化悬浮培养肝细胞，首先需要选择适合肝系细胞(包括HBs和肝细胞)粘附并支持其增殖、分化的微载体(Microcarrier)。目前，国内外研究已报道了多种微载体应用于原代肝细胞悬浮培养，包括Cytodex系列，多孔微载体Cultispher S和Cytopore等。但是，这些微载体都不能降解，难以收获肝细胞；此类微载体多用于以细胞分泌物为目的产品的细胞培养，可能不适用于以细胞本身为目的产物的肝系细胞生产。
[0006]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0007]本专利技术的目的在于提供一种用于悬浮培养条件下诱导肝细胞分化成熟的诱导培养基以及方法。
[0008]本专利技术是这样实现的：
[0009]第一方面，本专利技术实施例提供了一种用于悬浮培养条件下诱导肝细胞分化成熟的诱导培养基，所述诱导培养基是在肝细胞培养基中添加小分子组合获得的，所述小分子组合包含：地塞米松(DEX)、抑瘤素M(OSM)、Notch信号通路阻断剂和TGF
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β信号通路阻断剂。
[0010]第二方面，本专利技术实施例提供了一种悬浮培养条件下诱导肝细胞分化成熟的方法，其包括：采用如前述实施例所述的用于诱导肝细胞分化成熟的诱导培养基对肝祖细胞进行培养并诱导其分化为功能成熟的肝细胞。
[0011]本专利技术具有以下有益效果：
[0012]本专利技术通过在肝细胞培养基中添加包含有Notch信号通路阻断剂、TGF
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β信号通路阻断剂、DEX和OSM的小分子组合，并通过该培养基对肝祖细胞(Hepatoblasts，HBs)进行诱导分化，能够稳定高效的获得功能成熟的肝细胞。本专利技术建立了一种稳定高效的规模化制备功能成熟肝细胞的方法，为临床生物人工肝和肝细胞移植治疗提供了可靠的细胞来源，并为肝细胞在肝病机理研究、药物研发等领域的应用开拓了新思路和途径。
附图说明
[0013]为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0014]图1为微载体悬浮培养条件下诱导肝细胞分化；(A)微载体悬浮培养肝细胞的模式图；(B)细胞反应器悬浮培养肝细胞；(C)微载体图片，及微载体悬浮培养肝细胞图片；(D)HBs在微载体上分化为肝细胞，并表达ALB等肝细胞标志蛋白；
[0015]图2为悬浮3D培养促进胆管细胞相关基因和蛋白表达；(A)PCR检测肝细胞和胆管细胞相关基因的表达；(B)免疫荧光检测肝细胞和胆管细胞相关蛋白的表达；
[0016]图3为调控Notch，TGF
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β和Wnt等相关信号通路的小分子化合物对HBs细胞分化的影响；(A)小分子化合物对肝细胞分化的影响；(B)肝细胞成熟诱导的优选方案；
[0017]图4为建立悬浮培养条件下肝细胞成熟分化方法；(A)诱导成熟的肝细胞表达CYP酶和尿素代谢酶相关的基因；(B)诱导成熟的肝细胞表达ALB、CYP3A4等肝细胞标志蛋白。
具体实施方式
[0018]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或试剂和仪器的说明书的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0019]首先，本专利技术实施例提供了一种用于悬浮培养条件下诱导肝细胞分化成熟的诱导培养基，所述诱导培养基是在肝细胞培养基中添加小分子组合获得的，所述小分子组合DODS包含：DEX、OSM、Notch信号通路阻断剂和TGF
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β信号通路阻断剂。
[0020]本专利技术通过在肝细胞培养基中添加Notch的信号通路阻断剂、TGF
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β信号通路阻断剂、DEX和OSM，获得诱导肝细胞分化成熟的诱导培养基，该诱导培养基的化学成分明确且不含血清，通过采用该诱导培养基对HBs进行培养，能够高效诱导HBs分化为功能成熟的肝细胞，为临床生物人工肝和肝细胞移植治疗提供了可靠的细胞来源，同时也为每年增加的肝硬化患者以及急性肝中毒患者的治疗带来希望。
[0021]具体地，所述诱导培养基应用于悬浮培养条件下诱导HBs分化为功能成熟的肝细
胞。
[0022]HBs具有较强的增殖能力，同时具有快速向肝细胞和胆管细胞分化的双潜能。近年来，多个研究小组相继报道了扩增HBs的方法。然而，想要规模化生产并大量获取功能成熟的肝细胞，仍需解决诸多问题。其中关键的瓶颈问题是如何建立规模化生产功能成熟的肝细胞的方法。而本专利技术在肝细胞培养基中添加特定的小分子化合物组合DODS，使得该培养基能够高效稳定地诱导HBs分化为功能成熟的肝细胞。
[0023]本文中的“所述Notch信号通路阻断剂的作用浓度为1～50μM，所述TGF
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β信号通路阻断剂的作用浓度为1～50μM”，其中的作用浓度是指Notch信号通路阻断剂和TGF
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β信号通路阻断剂在诱导培养基中的作用浓度(终浓度)。
[0024]在没有限定的情况下，Not本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于悬浮培养条件下诱导肝细胞分化成熟的诱导培养基，其特征在于，所述诱导培养基是在肝细胞培养基上添加小分子组合获得的，所述小分子组合包含：地塞米松(DEX)、抑瘤素M(OSM)、Notch信号通路阻断剂和TGF
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β信号通路阻断剂。2.根据权利要求1所述的用于悬浮培养条件下诱导肝细胞分化成熟的诱导培养基，其特征在于，所述Notch信号通路阻断剂的作用浓度为1～50μM，所述TGF
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β信号通路阻断剂的作用浓度为1～50μM；优选地，所述Notch信号通路阻断剂包括DAPT、RO4929097和Dibenzazepine中的至少一种。3.根据权利要求1所述的用于悬浮培养条件下诱导肝细胞分化成熟的诱导培养基，其特征在于，所述TGF
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β信号通路阻断剂包括SB431542、A8301和RepSox中的至少一种。4.根据权利要求1所述的用于诱导肝细胞分化成熟的诱导培养基，其特征在于，在所述诱导培养基中，所述地塞米松的作用浓度为0.1～10μM，所述抑瘤素M的作用浓度为1～100ng/ml。5.根据权利要求1～4任一项所述的用于悬浮培养条件...

【专利技术属性】
技术研发人员：高毅，潘廷才，梁康檐，李阳，黎少，
申请(专利权)人：广东乾晖生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：