胆囊上皮细胞的建系方法、胆囊上皮细胞系及其应用技术

本发明专利技术提供了一种胆囊上皮细胞的建系方法，包括以下步骤：获得胆囊上皮细胞；对所述胆囊上皮细胞进行贴壁培养以得到原代细胞；使用永生化慢病毒和病毒感染试剂对所述原代细胞进行感染；对感染后的原代细胞继续培养直至至少部分细胞出现扩增成克隆后，使用细胞消化液进行贴壁细胞的消化以得到传代细胞；使用有限稀释法对所述传代细胞继续进行单克隆培养以得到上皮属性的阳性克隆产物；将所述上皮属性的阳性克隆产物继续扩增培养以得到永生化的胆囊上皮细胞系。本发明专利技术解决了现有技术中尚未有关于制备非胆囊癌永生化的胆囊上皮细胞系的问题。同时本发明专利技术提供了一种胆囊上皮细胞系及其应用。及其应用。及其应用。

【技术实现步骤摘要】
胆囊上皮细胞的建系方法、胆囊上皮细胞系及其应用


[0001]本专利技术涉及生物医药
，尤其涉及一种胆囊上皮细胞的建系方法、胆囊上皮细胞系及其应用。

技术介绍

[0002]胆囊相关疾病在消化道器官的各种疾病中的基础研究相对滞后，尤其表现在基础研究体系的工具模型的匮乏。细胞系是当前医学生物学、分子生物学实验室最常用的研究工具，而胆囊系统的细胞系模型，受到国际公认的当前仅有几株胆囊癌细胞系为NOZ、GBC
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SD、ZJU0430等，而目前并没有一株获得认可的正常的非肿瘤来源的胆囊上皮细胞系，这导致了当前胆囊相关疾病的基础研究受到了极大的限制。对胆囊上皮细胞进行建系的难度在于胆囊上皮细胞为终末分化细胞，少有继续分裂增殖的潜能。
[0003]目前，该领域最大的缺陷是非胆囊癌的胆囊上皮细胞系的缺失。该缺陷出现的原因是胆囊系统疾病相对于别的消化道器官的疾病研究而言，胆囊系统疾病的研究并非科学研究的热点，所以科研体系的基础工具模型还没有构建完全。该缺陷的存在还有其他两方面的原因：其一是现有技术对终末细胞构建细胞系的难度大，表现在单克隆来源成系的成功率不高，其二是混杂细胞系来源中如何提高上皮细胞的比例从而增大最终成系的细胞为上皮细胞来源的概率。
[0004]因此，有必要开发一种胆囊上皮细胞的建系方法、胆囊上皮细胞系及其应用以解决现有技术中存在的上述问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的在于提供一种胆囊上皮细胞的建系方法，本专利技术解决了现有技术中尚未有关于制备非胆囊癌永生化的胆囊上皮细胞系的问题。本专利技术所述的建系方法具有成功率高且最终成系的细胞为上皮细胞来源的概率大。
[0006]为实现上述目的，本专利技术提供了一种胆囊上皮细胞的建系方法，包括以下步骤：
[0007]S0：获得胆囊上皮细胞；
[0008]S1：对所述胆囊上皮细胞进行贴壁培养以得到原代细胞；
[0009]S2：使用永生化慢病毒和病毒感染试剂对所述原代细胞进行感染；
[0010]S3：对感染后的原代细胞继续培养直至至少部分细胞出现扩增成克隆后，使用细胞消化液进行贴壁细胞的消化以得到传代细胞；
[0011]S4：使用有限稀释法对所述传代细胞继续进行单克隆培养以得到上皮属性的阳性克隆产物；
[0012]S5：将所述上皮属性的阳性克隆产物继续扩增培养以得到永生化的胆囊上皮细胞系。
[0013]本专利技术所述的胆囊上皮细胞的建系方法的有益效果在于：获得胆囊上皮细胞；对所述胆囊上皮细胞进行贴壁培养以得到原代细胞；使用永生化慢病毒和病毒感染试剂对所
述原代细胞进行感染，以使得原代细胞具有永生化，能够传代至第三十代仍保持极性形态的特点；对感染后的原代细胞继续培养直至至少部分细胞出现扩增成克隆后，使用细胞消化液进行贴壁细胞的消化以得到传代细胞，对细胞进行筛选以得到能够扩增成克隆的细胞；使用有限稀释法对所述传代细胞继续进行单克隆培养以得到上皮属性的阳性克隆产物，对传代细胞进行筛选以得到上皮属性的阳性克隆产物；将所述上皮属性的阳性克隆产物继续扩增培养以得到永生化的胆囊上皮细胞系，对上皮属性的阳性克隆产物进行筛选以得到永生化的胆囊上皮细胞系。本专利技术解决了现有技术中尚未有关于制备非胆囊癌永生化的胆囊上皮细胞系的问题，同时本专利技术所述的建系方法具有成功率高且最终成系的细胞为上皮细胞来源的概率大，具有较好的应用前景。
[0014]可选的，所述使用永生化慢病毒和病毒感染试剂对所述原代细胞进行感染的步骤包括，使用所述永生化慢病毒和所述病毒感染试剂对所述原代细胞以MOI值为10进行感染24小时。
[0015]可选的，所述获得胆囊上皮细胞的步骤包括，用消化液对胆囊上皮进行消化解离成单细胞，并对所述单细胞进行筛选以得到所述胆囊上皮细胞。
[0016]可选的，所述获得胆囊上皮细胞的步骤包括：
[0017]S00：对胆囊组织的粘膜层进行解剖分离以得到胆囊上皮；
[0018]S01：使用消化液对所述胆囊上皮进行消化解离成单细胞；
[0019]S02：使用磁珠分选法对所述单细胞进行筛选以得到所述胆囊上皮细胞。
[0020]可选的，所述使用磁珠分选法对所述单细胞进行筛选以得到所述胆囊上皮细胞的步骤包括，使用阴性分选去除所述单细胞中的死细胞并使用阳性分选保留CD326阳性的单细胞作为所述胆囊上皮细胞。
[0021]可选的，所述永生化慢病毒包括hTERT慢病毒和SV large T抗原慢病毒，所述病毒感染试剂为聚凝胺，所述细胞消化液为胰蛋白酶，所述聚凝胺的浓度为8～10微克/毫升。
[0022]可选的，所述使用有限稀释法对所述传代细胞继续进行单克隆培养以得到上皮属性的阳性克隆产物的步骤包括，控制每孔100μL培养基中包含至多1个所述传代细胞。
[0023]本专利技术的另一目的是提供一种胆囊上皮细胞系，所述胆囊上皮细胞系由所述胆囊上皮细胞的建系方法得到的。
[0024]本专利技术的另一目的是提供一种胆囊上皮细胞系的有益效果在于：所述胆囊上皮细胞系解决了现有技术中尚未有关于非胆囊癌的胆囊上皮细胞系的问题，同时所述胆囊上皮细胞系的应用前景广阔。
[0025]可选的，所述胆囊上皮细胞系的保藏编号为CCTCC No:C2022201。
[0026]可选的，所述胆囊上皮细胞系为保藏于中国典型培养物保藏中心的存活样品，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏编号为CCTCC No:C2022201，分类命名为人胆囊上皮细胞系L
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2F7。
[0027]可选的，中国典型培养物保藏中心于2022年7月7日收到培养物并命名为人胆囊上皮细胞系L
‑
2F7。
[0028]本专利技术的又一目的是提供一种所述胆囊上皮细胞系的应用，所述胆囊上皮细胞系应用于制备治疗胆囊炎、胆囊息肉和胆囊结石药物。
[0029]本专利技术的再一目的是提供一种所述胆囊上皮细胞系的应用，所述胆囊上皮细胞系
应用于制备生物人工胆囊。
[0030]本专利技术的所述胆囊上皮细胞系的应用的有益效果在于：解决了现有技术中尚未有关于非胆囊癌永生化的胆囊上皮细胞系的问题，同时给出了所述胆囊上皮细胞系在制备治疗胆囊炎、胆囊息肉和胆囊结石药物中的应用以及在制备生物人工胆囊中的应用。
附图说明
[0031]图1为本专利技术实施例中上皮细胞的形态图；
[0032]图2为本专利技术实施例中第三代上皮细胞的形态图；
[0033]图3为本专利技术实施例中第十代上皮细胞的形态图；
[0034]图4为本专利技术实施例中第二十代上皮细胞的形态图；
[0035]图5为本专利技术实施例中第三十代上皮细胞的形态图；
[0036]图6为本专利技术实施例中蛋白质印迹法分析人胆囊细胞标志物的表达图；
具体实施方式
[0037]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种胆囊上皮细胞的建系方法，其特征在于，包括以下步骤：S0：获得胆囊上皮细胞；S1：对所述胆囊上皮细胞进行贴壁培养以得到原代细胞；S2：使用永生化慢病毒和病毒感染试剂对所述原代细胞进行感染；S3：对感染后的原代细胞继续培养直至至少部分细胞出现扩增成克隆后，使用细胞消化液进行贴壁细胞的消化以得到传代细胞；S4：使用有限稀释法对所述传代细胞继续进行单克隆培养以得到上皮属性的阳性克隆产物；S5：将所述上皮属性的阳性克隆产物继续扩增培养以得到永生化的胆囊上皮细胞系。2.根据权利要求1所述的胆囊上皮细胞的建系方法，其特征在于，所述使用永生化慢病毒和病毒感染试剂对所述原代细胞进行感染的步骤包括，使用所述永生化慢病毒和所述病毒感染试剂对所述原代细胞以MOI值为10进行感染24小时。3.根据权利要求1所述的胆囊上皮细胞的建系方法，其特征在于，所述获得胆囊上皮细胞的步骤包括：S00：对胆囊组织的粘膜层进行解剖分离以得到胆囊上皮；S01：使用消化液对所述胆囊上皮进行消化解离成单细胞；S02：使用磁珠分选法对所述单细胞进行筛选以得到所述胆囊上皮细胞。4.根据权利要求3所述的胆囊上皮细胞的建系方法，其特征在于，所述使用磁...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘颖斌，王子逸，
申请(专利权)人：上海交通大学医学院附属仁济医院，
类型：发明
国别省市：