体外诱导获得胰岛δ细胞的方法及其应用技术

本发明专利技术提供了体外诱导获得胰岛δ细胞的方法，培养基及其应用。培养基及其应用。

【技术实现步骤摘要】
体外诱导获得胰岛
δ
细胞的方法及其应用


[0001]本专利技术属于细胞分化和再生医学领域，具体涉及胰岛δ细胞的体外诱导方法，更具体地涉及一种由干细胞分化为胰腺前体细胞及胰岛δ细胞的方法。

技术介绍

[0002]人胰岛主要由4种内分泌细胞构成，分别为β细胞(分泌胰岛素
‑
Insulin)、α细胞(分泌胰高血糖素
‑
Glucagon)、δ细胞(分泌生长抑素
‑
SST)和PP细胞(分泌胰多肽
‑
Peptide)。一般认为α和β细胞分泌的胰高血糖素和胰岛素共同调节人体内的血糖平衡。在机体血糖较高时，β细胞会释放胰岛素促进机体糖原物质合成，降低血糖。机体低血糖时，胰岛α细胞分泌胰高血糖素，胰高血糖素增加肝脏中葡萄糖产生(主要通过糖原分解和糖异生)来提高血糖水平。尽管δ细胞在人胰岛内分泌细胞中只占5
‑
10％，但δ细胞可以通过调节β细胞上的特定生长抑素受体(SSTR)有效抑制胰岛素和胰高血糖素的释放。因此δ细胞可以有效抑制胰高血糖素和胰岛素的过度分泌，从而将血糖水平维持在一个狭窄的生理范围内。鉴于生长抑素在抑制胰岛素和胰高血糖素释放方面的功能，胰岛δ细胞的生理功能和胰岛δ细胞分泌的生长抑素的信号传导对攻克糖尿病的治疗都是十分有益的。
[0003]1973年Armelin等人在垂体和下丘脑的提取物中发现成纤维细胞生长因子(FGF,Fibroblast Growth Factor)。已发现的FGF家族成员被分为6个亚家族：5个旁分泌家族和1个内分泌家族。旁分泌家族分为：FGF1亚科(FGF1和FGF2)，FGF4亚科(FGF4、FGF5、FGF6)，FGF7亚科(FGF3、FGF7、FGF10、FGF22)，FGF8亚科(FGF8、FGF17、FGF18)，FGF9亚科(FGF9、FGF16、FGF20)，内分泌亚科FGF19(FGF19、FGF21、FGF23)。已有研究表明FGF通过旁分泌或内分泌方式调节多种生理活动，参与机体内的血管生成、组织修复、胚胎发育等过程，维护机体的正常生理结构。在实验室成功将人胚胎干细胞(Human Embryonic stem cell，ES)体外分化为胰岛δ细胞的基础上，研究不同亚科FGF对胰岛δ细胞分化的影响对于如何将人胚胎干细胞分化为胰岛δ细胞具有重大意义。

技术实现思路

[0004]本专利技术提供了在体外诱导分化得到胰腺前体细胞及胰岛δ细胞的方法，具体提供了一种将胚胎干细胞在体外诱导分化得到胰腺前体细胞及胰岛δ细胞的方法。本专利技术首先将胚胎干细胞分化形成定型内胚层细胞，之后分化形成胰腺前体细胞，再分化形成胰腺内分泌细胞，最后分化形成成熟的胰岛δ细胞。本专利技术的体外诱导方法简单易行。
[0005]第一方面，本专利技术提供了体外诱导获得胰岛δ细胞的方法，所述方法包括：
[0006](1)获得胰腺前体细胞的步骤，
[0007](2)培养胰腺前体细胞获得胰腺内分泌细胞的步骤，以及
[0008](3)培养胰腺内分泌细胞获得胰岛δ细胞的步骤，
[0009]任选地，步骤(2)包括利用添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基培养。
[0010]在一些实施方式中，步骤(1)中，胰腺前体细胞通过培养干细胞获得，优选地，所述
干细胞选自多能干细胞、胰腺干细胞、成体干细胞或胚胎干细胞；优选地，所述干细胞选自人源干细胞。
[0011]在一些实施方案中，步骤(1)包括利用添加成纤维细胞生长因子FGF7的培养基培养。在一些实施方案中，所述成纤维细胞生长因子FGF7的浓度在10
‑
200ng/ml的范围内，例如可以为10ng/ml、20ng/ml、50ng/ml、80ng/ml、100ng/ml、120ng/ml、150ng/ml、180ng/ml、200ng/ml或它们之间的任意值。
[0012]在一些实施方案中，步骤(2)和/或步骤(3)中，培养胰腺前体细胞获得胰腺内分泌细胞的培养基中不添加成纤维细胞生长因子FGF，优选地，步骤(2)中，在含有选自视黄酸(RA)、平滑化拮抗剂、BMP 1型受体抑制剂、蛋白激酶C激活剂、rho激酶抑制剂、Alk5抑制剂、ZnSO4、三碘甲状腺原氨酸(T3)、γ
‑
分泌酶抑制剂、重组人β细胞素(Human Recombinant Betacellulin)、肝素(Heparin)、Axl抑制剂和N
‑
乙酰基
‑
L
‑
半胱氨酸中的至少一种组分的培养基中培养胰腺前体细胞得到胰腺内分泌细胞；步骤(3)中，在含有三碘甲状腺原氨酸(T3)、肝素(Heparin)、ZnSO4、(
±
)
‑
α
‑
生育酚的培养基中培养胰腺内分泌细胞得到胰岛δ细胞。优选地，所述平滑化拮抗剂选自SANT1，所述BMP 1型受体抑制剂选自LDN193189和/或Noggin，所述蛋白激酶C激活剂选自PDBU和/或TBBP，所述rho激酶抑制剂选自Y27632，所述Alk5抑制剂选自ALK5iⅡ，所述γ
‑
分泌酶抑制剂选自compound E，所述Axl抑制剂选自R428。
[0013]在一些实施方案中，步骤(2)中，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF1亚科、FGF4亚科、FGF7亚科、FGF8亚科、FGF9亚科或FGF19亚科中的至少一种FGF，
[0014]优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF7亚科中的至少一种FGF，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为FGF7和/或FGF10，
[0015]优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF1亚科中的至少一种FGF，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为FGF2，
[0016]优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF1亚科中的至少一种FGF和选自FGF7亚科中的至少一种FGF，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为FGF2和FGF7，
[0017]优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF4亚科中的至少一种FGF，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为FGF4，
[0018]优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF9亚科中的至少一种FGF，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为FGF9，
[0019]优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF8亚科中的至少一种FGF，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为FGF8，
[0020]优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF19亚科中的至少一种FGF，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为FGF21，
[0021]优选地，添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中，FGF2的浓度在2
‑
100ng/ml的范围内，例如可以为2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、50本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.体外诱导获得胰岛δ细胞的方法，所述方法包括：(1)获得胰腺前体细胞的步骤，(2)培养胰腺前体细胞获得胰腺内分泌细胞的步骤，以及(3)培养胰腺内分泌细胞获得胰岛δ细胞的步骤，任选地，步骤(2)包括利用添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基培养。2.根据权利要求1所述的方法，步骤(1)中，胰腺前体细胞通过培养干细胞获得，优选地所述干细胞选自多能干细胞、胰腺干细胞、成体干细胞或胚胎干细胞；优选地，所述干细胞选自人源干细胞；优选地，步骤(1)包括利用添加成纤维细胞生长因子FGF7的培养基培养，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF7的浓度在10
‑
200ng/ml的范围内。3.根据权利要求1所述的方法，步骤(2)和/或(3)中，培养基中不添加成纤维细胞生长因子FGF，优选地，步骤(2)中，在含有选自视黄酸(RA)、平滑化拮抗剂、BMP 1型受体抑制剂、蛋白激酶C激活剂、rho激酶抑制剂、Alk5抑制剂、ZnSO4、三碘甲状腺原氨酸(T3)、γ
‑
分泌酶抑制剂、重组人β细胞素(Human Recombinant Betacellulin)、肝素(Heparin)、Axl抑制剂和N
‑
乙酰基
‑
L
‑
半胱氨酸中的至少一种组分的培养基中培养胰腺前体细胞得到胰腺内分泌细胞；优选地，所述平滑化拮抗剂选自SANT1，所述BMP 1型受体抑制剂选自LDN193189和/或Noggin，所述蛋白激酶C激活剂选自PDBU和/或TBBP，所述rho激酶抑制剂选自Y27632，所述Alk5抑制剂选自ALK5iⅡ，所述γ
‑
分泌酶抑制剂选自compound E，所述Axl抑制剂选自R428；步骤(3)中，在含有三碘甲状腺原氨酸(T3)、肝素(Heparin)、ZnSO4、(
±
)
‑
α
‑
生育酚的培养基中培养胰腺内分泌细胞得到胰岛δ细胞。4.根据权利要求1所述的方法，步骤(2)中，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF1亚科、FGF4亚科、FGF7亚科、FGF8亚科、FGF9亚科或FGF19亚科中的至少一种FGF，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF7亚科中的至少一种FGF，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为FGF7和/或FGF10，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF1亚科中的至少一种FGF，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为FGF2，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF1亚科中的至少一种FGF和选自FGF7亚科中的至少一种FGF，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为FGF2和FGF7，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF4亚科中的至少一种FGF，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为FGF4，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF9亚科中的至少一种FGF，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为FGF9，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF8亚科中的至少一种FGF，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为FGF8，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为选自FGF19亚科中的至少一种FGF，优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF为FGF21，优选地，添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中，FGF2的浓度在2
‑
100ng/ml的范围内，
优选地，添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中，FGF4的浓度在100
‑
400ng/ml的范围内，优选地，添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中，FGF7的浓度在2
‑
200ng/ml的范围内，优选地，添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中，FGF10的浓度50
‑
200ng/ml的范围内，优选地，添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中，FGF8的浓度在2
‑
100ng/ml的范围内，优选地，添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中，FGF9的浓度在50
‑
200ng/ml的范围内，优选地，添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中，FGF21的浓度在50
‑
100ng/ml的范围内，优选地，添加成纤维细胞生长因子FGF的培养基中，FGF2的浓度在2
‑
100ng/ml的范围内，并且FGF7的浓度在2
‑
200ng/ml的范围内。5.根据权利要求2所述的方法，步骤(1)通过培养干细胞获得胰腺前体细胞，优选地，步骤(1)包括培养干细胞获得定型内胚层细胞的步骤，以及依次在S2培养基和S3培养基中培养所述定型内胚层细胞获得胰腺前体细胞的步骤，其中，所述S2培养基和/或S3培养基中含有成纤维细胞生长因子FGF7；优选地，所述S2培养基为在基础培养基中添加成纤维细胞生长因子FGF7的培养基；优选地，所述成纤维细胞生长因子FGF7的浓度在10
‑
200ng/ml的范围内；优选地，所述S3培养基为在基础培养基中添加成纤维细胞生长因子FGF7、视黄酸(RA)、平滑化拮抗剂、BMP 1型受体抑制剂、蛋白激酶C激活剂和rho激酶抑制剂的培养基，优选地，所述平滑化拮抗剂选自SANT1，所述BMP 1型受体抑制剂选自LDN193189和/或Noggin，所述蛋白激酶C激活剂选自PDBU和/或TBBP，所述rho激酶抑制剂选自Y27632；步骤(2)包括依次在S4培养基、S5培养基和S6培养基中培养所述胰腺前体细胞获得胰腺内分泌细胞的步骤，其中S4培养基和/或S5培养基中含有所述成纤维细胞生长因子FGF，优选地，所述S4培养基为在基础培养基中添加所述成纤维细胞生长因子FGF、视黄酸(RA)、平滑化拮抗剂、BMP 1型受体抑制剂、蛋白激酶C激活剂、rho激酶抑制剂和Alk5抑制剂的培养基，优选地，所述平滑化拮抗剂选自SANT1，所述BMP 1型受体抑制剂选自LDN193189和/或Noggin，所述蛋白激酶C激活剂选自PDBU和/或TBBP，所述rho激酶抑制剂选自Y27632，所述Alk5抑制剂选自ALK5iⅡ，优选地，所述S5培养基为在基础培养基中添加所述成纤维细胞生长因子FGF、视黄酸(RA)、平滑化拮抗剂、BMP 1型受体抑制剂、ZnSO4、Alk5抑制剂、三碘甲状腺原氨酸(T3)、γ
‑
分泌酶抑制剂、重组人β细胞素(Human Recombinant Betacellulin)和肝素(Heparin)的培养基，优选地，所述平滑化拮抗剂选自SANT1，所述BMP 1型受体抑制剂选自LDN193189和/或Noggin，所述Alk5抑制剂选自ALK5iⅡ，所述γ
‑
分泌酶抑制剂选自compound E，优选地，所述S6培养基为在基础培养基中添加BMP 1型受体抑制剂、三碘甲状腺原氨酸(T3)、γ
‑
分泌酶抑制剂、肝素(Heparin)、Axl抑制剂、N
‑
乙酰基
‑
L
‑
半胱氨酸和ZnSO4的培养基，优选地，所述BMP 1型受体抑制剂选自LDN193189和/或Noggin，所述γ
‑
分泌酶抑制剂选
自compound E，所述Axl抑制剂选自R428。6.根据权利要求5所述的方法，所述定型内胚层细胞具有SOX17基因和FOXA2基因的表达；和/或，所述胰腺前体细胞具有PDX1基因的表达；和/或，所述胰腺内分泌细胞具有CHGA基因的表达；和/或，所述胰岛δ细胞具有SST和HHEX基因的表达。7.根据权利要求4所述的方法，所述方法包括：(1)获得胰腺前体细胞的步骤：(1
‑
1)利用添加重组人激活素
‑
A(Activin A)和WNT激动剂的S1培养基培养干细胞，获得定型内胚层细胞；优选地，利用S1培养基培养3天，每24小时更换一次培养基，培养条件为5％CO2，36
‑
38℃；优选地，WNT激动剂选自ChiR99021；(1
‑
2)利用添加成纤维细胞生长因子FGF7的S2培养基培养步骤(1
‑
1)得到的定型内胚层细胞；优选地，利用S2培养基培养2天，每24小时更换一次培养基，培养条件为5％CO2，36
‑
38℃；(1
‑
3)利用添加成纤维细胞生长因子FGF7、视黄酸(RA)、平滑化拮抗剂、BMP 1型受体抑制剂、蛋白激酶C激活剂、rho激酶抑制剂的S3培养基培养步骤(1
‑
2)得到的细胞，获得胰腺前体细胞；优选地，利用S3培养基培养1
‑
2天，每24小时更换一次培养基，培养条件为5％CO2，36
‑
38℃；优选地，所述平滑化拮抗剂选自SANT1，所述BMP 1型受体抑制剂选自LDN193189和/或Noggin，所述蛋白激酶C激活剂选自PDBU和/或TBBP，所述rho激酶抑制剂选自Y27632；(2)培养胰腺前体细胞获得胰腺内分泌细胞的步骤：(2
‑
1)利用添加所述成纤维...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘会生，陈利华，王楠楠，孟皓，陈婧仪，张枫，廖志赢，徐涛，
申请(专利权)人：广州国家实验室，
类型：发明
国别省市：