一种贴壁动物细胞的规模化低温保存方法技术

本发明专利技术提供了一种贴壁动物细胞的规模化低温保存方法，包括：(1)反应器中加入微载体和培养液，将细胞悬液按接种密度接种到反应器中培养，所述微载体呈实心无孔型；(2)待细胞满微载体时进行固液分离，得到微载体细胞；(3)加入预冷的培养液后进行混合重悬，放入0

【技术实现步骤摘要】
一种贴壁动物细胞的规模化低温保存方法


[0001]本专利技术涉及生物
，具体而言，涉及一种贴壁动物细胞的规模化低温保存方法。

技术介绍

[0002]贴壁动物细胞广泛用于包括疫苗、蛋白药物等生物制品的制备过程，常见的有Vero、MDCK、MRC
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5、WI
‑
38、CHO和293细胞等，而细胞冻存是细胞保存的常见方法之一。
[0003]对于贴壁生长的动物细胞而言，通常借助微载体和培养容器进行大规模培养。微载体提供细胞贴附的大量表面，细胞贴附在微载体表面生长扩增，微载体在培养容器中悬浮运动，培养容器提供细胞生长所需的营养成份和适宜环境，因此极大提高了生产效率和可控性。
[0004]若保存时，通常需从微载体上收获并制备单细胞悬液，再对单细胞悬液进行冻存，不仅操作繁杂且易造成细胞量损失；同时会破坏细胞与微载体的黏附关系而造成存活率降低。申请号201810556039.X的中国专利公开了一种动物细胞低温冷藏保存和运输的方法，包括：(1)细胞培养容器中加入处理好的多孔微载体和含血清培养基，将细胞悬液按所需接种密度接种到容器中培养；(2)细胞生长达到对数生长期后，用细胞活性保存液将培养基置换出来。(3)将附着在多孔微载体的细胞悬浮在细胞活性保存液中，转移到保存容器中，装液量要达到90％左右；(4)放入4
‑
8℃冷藏保存或运输。上述方法能避免反复冻融对细胞损害，但需定期更换特殊配方的保存液，保存细胞数量少，操作繁琐。
[0005]因此，有必要研发一种新的贴壁动物细胞保存方法。

技术实现思路

[0006]本专利技术解决的问题是如何稳定的实现动物细胞的规模化保存。
[0007]本专利技术提供一种贴壁动物细胞的规模化低温保存方法，包括：(1)反应器中加入微载体和培养液，将细胞悬液按接种密度接种到反应器中培养，所述微载体呈实心无孔型；(2)待细胞满微载体时进行固液分离，得到微载体细胞；(3)加入预冷的培养液后进行混合重悬，放入0
‑
8℃下冷藏保存或运输。
[0008]优选的，步骤(1)中代培养的细胞数量与所述微载体重量比为4
×
106～9
×
107个/g。
[0009]优选的，所述微载体的直径为25～750μm，密度为1.01～1.20g/ml。
[0010]优选的，步骤(1)所述细胞悬液为Vero细胞、MDCK细胞、MRC
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5细胞、WI
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38细胞、CHO细胞和293细胞中的任意一种，上述细胞均为表面依附性生长的贴壁细胞。
[0011]优选的，所述细胞悬液依次经细胞复苏、方瓶培养、转瓶培养获得。优选的，所述细胞悬液采用下述方式进行培养：a)细胞复苏从细胞种子库中取一支或多支细胞冻存管，解冻后在方瓶内进行细胞复苏，8～24时更换培养液；培养温度35℃～38℃，培养箱CO2浓度3％～7％，细胞生长至致密单层后进行消化传代；b)方瓶培养上述细胞在细胞方瓶中培养，
细胞贴附在方瓶内壁上生长，并传代2～4代；细胞传代比例为1：3～1：6，培养温度35℃～38℃，培养箱CO2浓度3％～7％，细胞生长至致密单层后进行消化传代；c)转瓶培养将上述方瓶中的细胞接种入转瓶，细胞贴附在转瓶内壁上生长，并进行培养传代2～4代；传代比例1：5～1：6比例，培养温度35℃～38℃，转瓶机转速7～13rpm，细胞生长至致密单层后进行消化传代。所述“细胞传代比例”指“供细胞生长的面积”，1：3表示1个方瓶细胞可传出3个同样的方瓶细胞。
[0012]优选的，步骤(2)中通过离心或静置的方式进行固液分离，离心转速为500～1000rpm，1～5min，静置时确保悬液液面不高于30cm时，自然沉降10min以上。
[0013]优选的，步骤(3)中所述培养液为199或DMEM或MEM培养液，并在所述培养液中加入1％～12％牛血清或0.1～0.5％人血白蛋白。上述操作均为无菌操作，所用溶液和样品以密闭方式保存，防止被外源微生物污染。
[0014]步骤(3)中保存微载体细胞的容器材质可以是玻璃、不锈钢、PP或其他高分子材料，可耐压力且能经受蒸汽高压灭菌或辐照灭菌。优选的，步骤(3)中混合重悬后，以10
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20rpm离心3
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5min，弃取上清使微载体细胞与营养液的质量体积比为1g:0.5
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0.8ml。混合后的微载体细胞由于密度过大而自然沉降，申请人研究发现：沉降对细胞生长无影响，对其进行轻微离心后能够缩小体积，有利于保存、运输。
[0015]优选的，所述培养液的温度为0
‑
8℃。优选的，所述培养液的温度为保存或运输温度+5℃，该设置可分段进行降温，避免温度下降过快使细胞产生应激反应。优选的，所述培养液与微载体细胞混合后按照0.2
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0.5℃/min进行降至设定温度。
[0016]优选的，步骤(3)中保存或运输温度为0
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8℃；在不结冰的前提下，温度越低越好，防止产生冰晶对细胞造成损伤。
[0017]相对于现有技术，本专利技术所述的贴壁动物细胞的规模化低温保存方法具有下述有益效果：不需要额外的冻存剂即可实现动物细胞的规模化保存或运输；保存体积小，操作简单可靠，便于实施。
附图说明
[0018]图1为本专利技术实施例1中微载体细胞在低温存放过程中的细胞图片；
[0019]图2为本专利技术实施例1中微载体细胞在低温存放中的细胞活性数据；
[0020]图3为本专利技术实施例1中微载体细胞经低温存放后在T75方瓶的生长情况；
[0021]图4为本专利技术实施例2中微载体细胞在低温存放过程中的细胞图片；
[0022]图5为本专利技术实施例2中微载体细胞在低温存放中的细胞活性数据；
[0023]图6为本专利技术实施例2中存放的微载体细胞接种病毒后的微载体细胞图(MOI0.025)
[0024]图7为本专利技术实施例2存放的微载体细胞在接种病毒后的微载体细胞图(MOI0.005)
[0025]图8为本专利技术实施例2存放的微载体细胞在接种病毒后的微载体细胞图(MOI0.001)
[0026]图9为本专利技术实施例3中微载体细胞在低温存放过程中的细胞图片；
[0027]图10为本专利技术实施例3中微载体细胞在低温存放中的细胞活性数据
[0028]图11为本专利技术实施例3中微载体细胞经低温存放后在T75方瓶的生长情况。
具体实施方式
[0029]为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本专利技术的具体实施例做详细的说明。
[0030]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。相关的开口操作均是在生物安全柜或层流保护下，或采用无菌管道连接技术进行的无菌操作。所述微载体(Cytodex 1)是美国思拓凡公司的产品，产品目录号(货号)为17...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种贴壁动物细胞的规模化低温保存方法，其特征在于，包括：(1)反应器中加入微载体和培养液，将细胞悬液按接种密度接种到反应器中培养，所述微载体呈实心无孔型；(2)待细胞满微载体时进行固液分离，得到微载体细胞；(3)加入预冷的培养液后进行混合重悬，放入0
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8℃下冷藏保存或运输。2.根据权利要求1所述的贴壁动物细胞的规模化低温保存方法，其特征在于，步骤(1)中接种的细胞数量与所述微载体重量比为4
×
106～9
×
107个/g。3.根据权利要求2所述的贴壁动物细胞的规模化低温保存方法，其特征在于，所述微载体的直径为25～750μm，质量密度为1.01～1.20g/ml。4.根据权利要求2所述的贴壁动物细胞的规模化低温保存方法，其特征在于，步骤(1)所述细胞为Vero细胞、MDCK细胞、MRC
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5细胞、WI
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38细...

【专利技术属性】
技术研发人员：原国强，郭宏庄，韩斌，董洁，闫凯，王越，
申请(专利权)人：华兰生物疫苗股份有限公司，
类型：发明
国别省市：