【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物，具体而言，涉及带状疱疹病毒ge蛋白的制备方法、应用及疫苗组合物。
技术介绍
1、带状疱疹(herpeszoster,hz)是由潜伏在背根神经和颅神经的神经元及肠肌间神经元中的水痘—带状疱疹病毒(varicella-zostervirus,vzv)重新激活引起的疾病。vzv是一种α疱疹病毒，仅有一个血清型，感染局限于人类及部分高级灵长类动物。病毒颗粒为圆形或多边形，中央有1个双链dna核心。糖蛋白e(ge)是vzv表达最丰富的一种糖蛋白，并且具有高度的免疫原性，在病毒感染细胞以及病毒在细胞间的扩散中发挥重要作用。带状疱疹的症状通常包括全身不适、发热、寒战、肌痛、头痛、瘙痒、麻木及皮疹。除了上述症状外，有些患者还伴有hz并发症，常见的有脑膜炎、三叉神经受累导致的眼部结构损害、hz后神经痛(postherpeticneuralgia,phn)等。hz药物治疗一般在及时规范的系统抗病毒药物治疗基础上，予镇静止痛类、免疫调节类、营养神经类药物等。现阶段带状疱疹的药物治疗中，抗病毒药物利用率低且有副作用，而非抗病毒药物效果不佳。
2、据国内外流行病学调查发现，在患疱疹病例的人群中存在大量的hz高位人群，不易发生带状疱疹病症，但随着年龄增长，特别是过了50岁以后，人体针对vzv的细胞介导免疫功能减弱，即常说的抵抗力下降，很多人体脊髓后根神经节或颅神经节内潜伏的vzv就有可能激活，病毒一旦激活就会大量复制，通过感觉神经轴突转移到皮肤，引起带状疱疹及产生相关并发症。
3、在缺乏药物治愈的情况下，现阶段疫
4、然而利用目前已有的蛋白培养的方法培养的带状疱疹病毒ge蛋白纯度和活性较差，无法满足带状疱疹疫苗的开发需求。
技术实现思路
1、为解决上述问题，本专利技术提供一种带状疱疹病毒ge蛋白的制备方法、应用及疫苗组合物。本专利技术通过基因重组技术构建重组cho细胞，经过批次补料培养方式获得稳定表达目的蛋白的细胞培养液，将细胞培养液经过离子、疏水、分子筛层析等一系列纯化步骤后获得纯度达到98％以上的带状疱疹病毒ge蛋白。将该带状疱疹病毒ge蛋白与cpg、mpl佐剂组合获得高免疫原性的带状疱疹疫苗。
2、具体的，本专利技术提供了带状疱疹病毒ge蛋白的制备方法，包括以下步骤：
3、s1：将表达vzv-ge蛋白的宿主细胞传代培养后进行补料培养后获得细胞培养液；
4、s2：将细胞培养液经过离子层析、疏水层析和凝胶过滤层析后获得vzv-ge纯化蛋白。
5、s3：将vzv-ge纯化蛋白冻干处理后得到冻干vzv-ge蛋白；
6、其中，所述宿主细胞为锌脂核酸酶修饰的gs缺陷型cho细胞。该宿主细胞无需进行细胞加压选择步骤，筛选流程简单且目标蛋白表达量高。
7、利用本专利技术提供的制备方法获得的vzv-ge蛋白纯度高、活性好，冻干复融后蛋白纯度大于95％，且内毒素含量少，与佐剂cpg和mpl混合后制备的疫苗具有很好的免疫原性，可用于临床上带状疱疹病毒的预防。
8、优选的，所述s1步骤中传代培养的起始细胞密度为(0.3～0.5)*106cells/ml，传代培养的参数为37℃、120±5rpm、5％co2。在本专利技术的实施例中，所述传代培养之前需要将重组后的表达vzv-ge蛋白的宿主细胞进行复苏培养，包括将冷冻复融后的细胞培养液在cho细胞培养基上划线培养，待菌落长出后挑取单菌落进行传代培养。
9、在一些具体的实施例中，所述s1步骤中补料培养的步骤为：每天检测培养基中细胞密度和细胞活率，隔天检测培养基中葡萄糖的含量，第3～5天补糖量为(葡萄糖初始浓度-葡萄糖检测浓度)+2～3g/l，后续每隔一天补加葡萄糖浓度至6g/l，在第6天使培养温度降至32℃；
10、每天补加培养液总体积1.67％的培养基ex-celladvancedfeed1和培养液总体积0.83％的培养基cellvento4feedcomp。
11、在所述s2步骤中，离子层析的步骤包括用0.5mol/l naoh、1mol/l nacl、20mmol/l哌嗪分别以3倍柱体积预处理阴离子mustang q填料层析柱，细胞培养液上样后分别用20mmol/l哌嗪、260mmol/l nacl洗脱液和20mmol/l哌嗪、160mmol/l nacl洗脱液依次进行洗脱，洗脱流速为1～5ml/min，优选为1ml/min。
12、所述s2步骤中，疏水层析的步骤包括用0.5mol/l naoh、1mol/l nacl、20mmol/lpb和1mol/l(nh4)2so4分别以3倍柱体积预处理疏水butyl 4ff填料层析柱，将离子层析步骤中的洗脱液的ph值调节到7.0～7.5后上样，优选ph值为7.17，然后分别用20mmol/l pb、470mmol/l(nh4)2so4洗脱液和20mmol/l pb、35mmol/l(nh4)2so4洗脱液依次进行洗脱，洗脱流速为1～5ml/min，优选为1ml/min。
13、所述s2步骤中，凝胶过滤层析的步骤包括用0.5mol/l naoh、1mol/lnacl、20mmol/l pb和0.14mol/l nacl分别以1.5倍柱体积预处理chromdex75pg填料层析柱，将疏水层析步骤中的洗脱液上样后收集。
14、进一步的，所述s2步骤中在离子层析步骤前需要对细胞培养液进行预处理，包括将细胞培养液用孔径为0.22μm的过滤器过滤后用hcl将细胞培养液的ph值调节到6.0～6.5。优选的，将所述细胞培养液的ph值调节到6.03。
15、在一些具体的实施例中，所述阴离子mustangq填料层析柱的柱径比为21～31；所述疏水butyl4ff填料层析柱的柱径比为10～20；所述chromdex75pg填料层析柱的柱径比为20～30。作为优选，所述阴离子mustangq填料层析柱的柱径比为21；所本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.带状疱疹病毒gE蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述S1步骤中传代培养的起始细胞密度为(0.3～0.5)*106cells/mL，传代培养的参数为37℃、120±5rpm、5％CO2。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述S1步骤中补料培养的步骤为：第3～5天补糖量为(葡萄糖初始浓度-葡萄糖检测浓度)+2～3g/L，后续每隔一天补加葡萄糖浓度至6g/L，在第6天使培养温度降至32℃；
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述S2步骤中离子层析的步骤包括用0.5mol/L NaOH、1mol/L NaCl、20mmol/L哌嗪分别以3倍柱体积预处理阴离子MustangQ填料层析柱，细胞培养液上样后分别用20mmol/L哌嗪、260mmol/L NaCl洗脱液和20mmol/L哌嗪、160mmol/LNaCl洗脱液依次进行洗脱，洗脱流速为1～5mL/min。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述S2步骤中疏水层析的步骤包括用0.5mol/
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述S2步骤中凝胶过滤层析的步骤包括用0.5mol/L NaOH、1mol/L NaCl、20mmol/L PB和0.14mol/L NaCl分别以1.5倍柱体积处理Chromdex 75pg填料层析柱，将疏水层析步骤中的洗脱液上样后收集。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述S2步骤中在离子层析步骤前需要对细胞培养液进行预处理，包括将细胞培养液用孔径为0.22μm的过滤器过滤后用HCl将细胞培养液的pH值调节到6.0～6.5。
8.根据权利要求4-6任一项所述的制备方法，其特征在于，所述阴离子Mustang Q填料层析柱的柱径比为21～31；所述疏水Butyl 4FF填料层析柱的柱径比为10～20；所述Chromdex 75pg填料层析柱的柱径比为20～30。
9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述S3步骤中冻干处理的步骤包括将纯化后的VZV-gE蛋白与8％浓度的蔗糖溶液、0.01％浓度的吐温80混匀后用PBS缓冲液定容到蛋白浓度为100μg/mL，再进行冻干处理；所述VZV-gE蛋白、8％蔗糖溶液与0.01％吐温80的体积比为(92％～96％)：(4％～8％)：(0.01％～0.05％)。
10.权利要求1-9任一项所述制备方法获得的带状疱疹病毒gE蛋白在制备疫苗中的应用。
11.一种疫苗组合物，其特征在于，包括根据权利要求1-9任一项所述制备方法获得的带状疱疹病毒gE蛋白和CpG、MPL佐剂。
...【技术特征摘要】
1.带状疱疹病毒ge蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述s1步骤中传代培养的起始细胞密度为(0.3～0.5)*106cells/ml，传代培养的参数为37℃、120±5rpm、5％co2。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述s1步骤中补料培养的步骤为：第3～5天补糖量为(葡萄糖初始浓度-葡萄糖检测浓度)+2～3g/l，后续每隔一天补加葡萄糖浓度至6g/l，在第6天使培养温度降至32℃；
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述s2步骤中离子层析的步骤包括用0.5mol/l naoh、1mol/l nacl、20mmol/l哌嗪分别以3倍柱体积预处理阴离子mustangq填料层析柱，细胞培养液上样后分别用20mmol/l哌嗪、260mmol/l nacl洗脱液和20mmol/l哌嗪、160mmol/lnacl洗脱液依次进行洗脱，洗脱流速为1～5ml/min。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述s2步骤中疏水层析的步骤包括用0.5mol/l naoh、1mol/l nacl、20mmol/l pb和1mol/l(nh4)2so4分别以3倍柱体积预处理疏水butyl4ff填料层析柱，将离子层析步骤中的洗脱液的ph值调节到7.0～7.5后上样，然后分别用20mmol/l pb、470mmol/l(nh4)2so4洗脱液和20mmol/l pb、35mmol/l(nh4)2so4洗脱液依次进行洗脱，洗脱流速为1～5ml...
【专利技术属性】
技术研发人员：孟丽，崔晓峰，蔡林林，杨清霞，王魁，
申请(专利权)人：华兰生物疫苗股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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