多孔微载体及其制备方法技术

本发明专利技术公开了多孔微载体及其制备方法。制备方法是首先将人源化基因重组胶原蛋白和/或可降解生物大分子溶液或其混合溶液调节pH至4.0

【技术实现步骤摘要】
多孔微载体及其制备方法


[0001]本专利技术属于医药材料
更具体地，涉及多孔微载体及其制备方法。

技术介绍

[0002]目前，为了收获组织修复活性更高的细胞，业内多将可降解生物材料制备成微载体后，将细胞接种于其上进行悬浮培养扩增。常用的商业化微载体如cytodex1、cytodex3等。
[0003]但现有的微载体不具备多孔特征，细胞仅能在其表面贴壁与增殖，扩增效率有限；此外，其不能被胰蛋白酶、胶原蛋白酶或胰酶替代物裂解，在收获细胞后还需进行细胞悬液与微载体的分离，操作步骤繁琐，且细胞扩增倍数有限；而且与二维培养类似，在收获细胞时需要使用胰蛋白酶对细胞进行消化，而目前上市场所能购买到的胰蛋白酶主要是从猪、牛等动物胰脏中提取而来，存在着潜在的病毒污染风险，因此，使用胰蛋白酶消化所收获的细胞将难以通过安全验证，从而无法回输到临床病人体内。另外，胰蛋白酶的长时间消化也会极大损伤细胞活性，降低其最终的组织修复效果。
[0004]中国专利申请提供了一种三维多孔微载体，具备多孔特征且能调节孔径，具有较高的孔隙率，因而比cytodex1、cytodex3具有更大的比表面积和更高的细胞扩增效率；但是，其在裂解时，还是需要使用到动物来源的酶，如胶原蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶等配制的裂解液，存在病毒跨物种传播风险。

技术实现思路

[0005]本专利技术要解决的技术问题是克服上述现有微载体的缺陷和不足，提供一种可充分裂解的多孔微载体，其具有较高的孔隙率，具有更大的比表面积和更高的细胞扩增效率；合适的交联密度可使其可在细胞增殖期间保持稳定，待细胞扩增结束后，仅在胰酶替代物的作用下，可在短时间内完成充分裂解，这样既能够省去细胞收获后分离微载体的繁琐，又能够避免病毒的跨物种传播，收获具有高组织修复活性的细胞。
[0006]本专利技术的目的是提供多孔微载体及其制备方法。
[0007]本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：
[0008]多孔微载体的制备方法，包括如下步骤：
[0009]S1.制备生物大分子溶液；
[0010]提供人源化基因重组胶原蛋白溶液和/或可降解生物大分子溶液或其混合溶液；
[0011]S2.制备水相溶液：
[0012]将步骤S1的生物大分子溶液调节pH值至4.0
‑
9.0后预冷，与试剂A充分混合，得到均匀混合液；再添加体积终浓度为0.01
‑
5％(或质量终浓度为0.001
‑
8％)的试剂C，混合均匀，得水相溶液；
[0013]其中，所述试剂A包括试剂B或离子盐；所述试剂B选自甲醇、乙醇、异丙醇、乙二醇、丙二醇、二甘醇、乙二醇丁醚、丙二醇丁醚、二氯甲烷、1,1
‑
二氯乙烷、1,2
‑
二氯乙烷、乙二醇
丁醚醋酸酯、二甲基亚砜、甲酰胺中的至少一种；
[0014]所述试剂C选自戊二醛、甲醛、京尼平、转谷酰胺酶、硫酸铵、(1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐、N
‑
羟基琥珀酰亚胺、N
‑
羟基硫代琥珀酰亚胺、2
‑
(7
‑
氮杂苯并三氮唑)
‑
N,N,N',N'
‑
四甲基脲六氟磷酸酯、1
‑
羟基苯并三氮唑、六氟磷酸苯并三唑
‑1‑
基
‑
氧基三吡咯烷基磷、二环己基碳二亚胺中的至少一种；
[0015]S3.乳液法反应制备微载体：
[0016]将油相溶剂充分预冷后，将步骤S2的水相溶液加入到油相溶剂中进行乳化，得到W/O型乳液；将乳液迅速冷却后转移至
‑
20℃或更低温度，继续反应不低于6小时，优选12
‑
24小时；
[0017]S4.微载体的清洗与收集：
[0018]取出乳液，待其融化，去除液体成分，沉淀物清洗干净后，筛分出所需粒径范围内的颗粒，冻干后获得分散的三维微载体，即为可充分裂解的多孔微载体。
[0019]上述制备获得的三维多孔微载体进行紫外或辐照灭菌后，可接种细胞进行悬浮培养，待其扩增结束后，仅通过添加胰酶替代物便可对微载体进行充分裂解，离心后去除上清即可收获细胞。
[0020]本专利技术所述“重组胶原蛋白”，是指：采用重组DNA技术，对编码所需人胶原蛋白质的基因进行遗传操作和(或)修饰，利用质粒或病毒载体将目的基因带入适当的宿主细胞(细菌、酵母或其它真核细胞等)中，表达并翻译成胶原蛋白或类似胶原蛋白的多肽，经过提取和纯化等步骤制备而成。本专利技术采用基于重组胶原蛋白制备的可充分裂解的多孔微载体，具有成分清晰、无病原体、孔径可调、孔隙率大、比表面积高、生物活性好等诸多优点。此外，胰酶替代物亦为非动物来源，其与采用基于重组胶原蛋白制备的微载体的配合使用，可以保证在整个细胞的规模化扩增过程中完全避免动物来源的任何原材料的使用，从而杜绝了生物安全隐患。
[0021]本专利技术所述人源化基因重组胶原蛋白包含各类工程菌构建的人源化基因重组胶原蛋白；所述人源化基因重组胶原蛋白亦可为其衍生物，包括但不限于甲基丙烯酸化人源基因重组胶原蛋白。
[0022]优选地，步骤S2中，所述生物大分子溶液的质量浓度为2
‑
25％，生物大分子溶液与试剂A的质量比为5
‑
22000。
[0023]优选地，步骤S2中，所述离子盐选自磷酸钠、磷酸钾、磷酸一氢钠、磷酸一氢钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸氢钠、硫酸氢钾、硫酸镁、硝酸钠、硝酸钾、氯化镁、氯化钾、氯化钙、氯化钠和氯化钡中的至少一种。
[0024]优选地，步骤S3中，所述油相溶剂选自所述油相溶剂选自乙醇、硬脂酸、十二烷基苯磺酸钠、季铵化物、正丙醇、异丙醇、氨基酸型表面活性剂、甜菜碱型表面活性剂、丙二醇、卵磷脂、丙三醇、甲苯、正己烷、食用油、二甲苯、石油醚、蓖麻油、烷基酚聚氧乙烯醚、脂肪醇聚氧乙烯醚、吐温(或聚山梨酯)、净洗剂6501、花生油、大豆油、烷基葡糖苷(APG)、脂肪酸甘油酯、脂肪酸山梨坦(或司盘)、橄榄油、山茶油、液态石蜡、环己烷、氢氟醚、油酸酯、亚油酸乙酯、肉豆蔻酸异丙酯、辛酸/癸酸甘油三酯、油酸/亚油酸甘油三酯中的至少一种；
[0025]优选地，步骤S3中，所述水相溶液和油相溶剂的体积比为1:2
‑
1:30。
[0026]步骤S3中，迅速冷却的方法是利用
‑
20℃、
‑
80℃、冰水混合物、液氮，或温度介于冰
水混合物与液氮之间的冷却液中的一种。
[0027]优选地，步骤S4中，乳液融化后可先用中和液进行中和，所述中和液可选自氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液、碳酸氢钠溶液、碳酸氢钾溶液、磷酸钠溶液、磷酸钾溶液、磷酸氢钠溶液、磷酸氢钾溶液、氨水、硼氢化钠溶液、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.多孔微载体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1.制备生物大分子溶液；提供人源化基因重组胶原蛋白溶液和/或可降解生物大分子溶液或其混合溶液；S2.制备水相溶液：将步骤S1的生物大分子溶液调节pH值至4.0
‑
9.0后预冷，与试剂A充分混合，得到均匀混合液；再添加体积终浓度为0.01
‑
5％或质量终浓度为0.001
‑
8％的试剂C，混合均匀，得水相溶液；其中，所述试剂A包括试剂B或离子盐；所述试剂B选自甲醇、乙醇、异丙醇、乙二醇、丙二醇、二甘醇、乙二醇丁醚、丙二醇丁醚、二氯甲烷、1,1
‑
二氯乙烷、1,2
‑
二氯乙烷、乙二醇丁醚醋酸酯、二甲基亚砜、甲酰胺中的至少一种；所述试剂C选自戊二醛、甲醛、京尼平、转谷酰胺酶、硫酸铵、(1
‑
(3
‑
二甲氨基丙基)
‑3‑
乙基碳二亚胺盐酸盐、N
‑
羟基琥珀酰亚胺、N
‑
羟基硫代琥珀酰亚胺、2
‑
(7
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氮杂苯并三氮唑)
‑
N,N,N',N'
‑
四甲基脲六氟磷酸酯、1
‑
羟基苯并三氮唑、六氟磷酸苯并三唑
‑1‑
基
‑
氧基三吡咯烷基磷、二环己基碳二亚胺中的至少一种；S3.乳液法反应制备微载体：将油相溶剂充分预冷后，将步骤S2的水相溶液加入到油相溶剂中进行乳化，得到W/O型乳液；将乳液迅速冷却后转移至
‑
20℃或更低温度，继续反应不低于6小时；S4.微载体的清洗与收集：取出乳液，待其融化，去除液体成分，沉淀物清洗干净后，筛分出所需粒径范围内的颗粒，冻干后获得分散的三维微载体，即为可充分裂解的多孔微载体。2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S2中，所述生物大分子溶液的质量浓度为2
‑
25％，生物大分子溶液与试剂A的质量比为5
‑
22000。3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S2中，所述离子盐选自磷酸钠、磷酸钾、磷酸一氢钠、磷酸一氢钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸氢钠、硫酸氢钾、硫酸镁、硝酸钠、硝酸钾、氯化镁、氯化钾、氯化钙、氯化钠和氯化钡中的至少一种。4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤S3中，所述油相溶剂选自乙醇...

【专利技术属性】
技术研发人员：张智勇，宋李治，王文浩，
申请(专利权)人：中科睿极深圳医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：