一种分离提取胃癌组织来源细胞外囊泡多种亚群的方法技术

本发明专利技术公开了一种分离提取胃癌组织来源细胞外囊泡多种亚群的方法，属于生物医学技术领域。所述方法为先将肿瘤组织浸入消化液中进行酶解消化，获得组织消化上清液，同时配制不同的消化液来优化酶解消化工艺，然后对组织消化上清液分别进行多次差速离心，从而获得组织来源细胞外囊泡及其亚群。这种分离提取方法成本低、试剂易获得、配制简单、品牌可选择范围广，而且优选用胶原酶II和DNaseI配制的消化液比用其他消化液的提取效率高，能更加真实地反映肿瘤来源细胞外囊泡的生物学功能和作用模式，还有助于肿瘤组织来源细胞外囊泡提取技术的发展。的发展。

【技术实现步骤摘要】
一种分离提取胃癌组织来源细胞外囊泡多种亚群的方法


[0001]本专利技术涉及生物医学
，特别涉及一种分离提取胃癌组织来源细胞外囊泡多种亚群的方法。

技术介绍

[0002]细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)的直径多为30nm
‑
150nm，拥有双层脂质膜结构，细胞外囊泡由体内多种细胞分泌，其内包含了多种来源于母细胞的蛋白质、RNA等多种生物活性物质，能参与细胞通讯、细胞迁移、血管新生和肿瘤细胞生长等过程，广泛地存在于各种体液和组织间隙中，并稳定携带了一些重要的信号分子。细胞外囊泡进入细胞外基质后能够定向移动，并特异性地与靶细胞结合，通过与靶细胞表面受体结合而激活胞内信号级联反应，也可以通过细胞外囊泡的囊泡内化、融合作用将内部的生物活性物质直接释放入靶细胞内，导致靶细胞的生物学功能发生改变，从而达到相应的调控作用。细胞外囊泡的生物作用广泛，不同细胞来源的EVs所运载的特异性生物活性物质能够在不同的环境中起到重要的调控作用。而且细胞外囊泡由于稳定的双层脂质膜结构，能够抵御大部分的降解、破坏作用，拥有良好的运载潜力。在目前的研究中，大多数细胞外囊泡都是通过细胞系的分泌得来，而探究细胞外囊泡对机体的病理生理学功能，在肿瘤疫苗、生物标志物、化疗药物载体、靶向生物治疗等领域具有重要的指导价值。但是，人体组织中的细胞构成十分复杂，多种细胞通过一定的分布构成人体组织即可发挥正常的生理功能，因此，通过体外培养的细胞系提取的细胞外囊泡并不能真实反映细胞外囊泡在人体内的生物学功能。r/>[0003]近年来，由于组织来源的细胞外囊泡(tissue
‑
derived extracellular vesicles)能直接从组织样本中分离提取得到，且通过对提取到的细胞外囊泡进行亚群分类、蛋白组学及转录组学检测，能够发现组织细胞外囊泡所包含的更多病理生理学信息，可以更加真实地反映肿瘤来源细胞外囊泡的生物学功能和作用模式，这些发现使得组织来源细胞外囊泡的概念逐渐被推广。但是作为细胞外囊泡研究的新兴领域，组织来源细胞外囊泡的提取技术还处于摸索阶段，而且多种恶性肿瘤的组织来源细胞外囊泡尚未具备准确高效的提取技术，对于组织来源外泌体的具体构成也尚未清楚。目前，组织来源细胞外囊泡的提取方法主要有酶消化法和浸出法两种，但由于使用的分子排阻色谱法(Size exclusion chromatography，SEC)、超滤管、消化酶成本过高，试剂应用复杂，操作步骤繁琐等问题，所以无法进行广泛的应用。在现有的研究中，已发现肾癌、黑色素瘤组织来源的细胞外囊泡并不是统一的整体，存在多种亚群分群的情况，而胃癌作为发病率很高的恶性肿瘤之一，还没有明确胃癌组织来源细胞外囊泡的亚群分群情况，也没有相关的提取技术标准。因此，如果能分离提取出胃癌组织来源细胞外囊泡的多种亚群，则可以真实地反映胃癌组织来源细胞外囊泡的生物学功能和作用模式。

技术实现思路

[0004]本专利技术通过配制一种消化液优化酶解消化工艺，再结合差速离心法分离提取了胃
癌组织来源的细胞外囊泡多种亚群，以解决目前胃癌组织来源细胞外囊泡亚群的分离提取方法较少以及成本过高的问题。
[0005]为了实现上述目的，本专利技术的技术方案如下：
[0006]一种分离提取胃癌组织来源细胞外囊泡多种亚群的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
[0007]步骤1：将胃癌组织浸入配制的消化液中进行酶解消化过滤后得到组织消化上清液，所述消化液为胶原酶II和脱氧核糖核酸酶I的混合液，或胶原酶IV和脱氧核糖核酸酶I的混合液，所述消化液也可以是乙二胺四乙酸和二硫苏糖醇的混合液与胶原酶IV的组合溶液；
[0008]步骤2：取步骤1的消化上清液以500g
‑
1000g，4℃离心10
‑
15分钟，再取离心后的上清液以3000g
‑
5000g，4℃离心15
‑
20分钟后收集上清液；
[0009]步骤3：取步骤2收集的上清液再次以15000
‑
17000g，4℃超速离心15
‑
30分钟，并收集上清液过滤后再以50000
‑
120000g，4℃超速离心60
‑
100分钟，得到沉淀即为胃癌组织来源细胞外囊泡亚群一；
[0010]步骤4：收集步骤3离心后的上清液于150000
‑
200000g，4℃超速离心60
‑
100分钟，再次得到沉淀为胃癌组织来源细胞外囊泡亚群二。
[0011]优选地，所述消化液优选胶原酶II和脱氧核糖核酸酶I的混合液。
[0012]优选地，所述步骤2的超速离心优选收集步骤1的上清液以500g，4℃离心10分钟，再取离心后的上清液以3000g，4℃离心20分钟后收集上清液。
[0013]优选地，所述步骤3的超速离心优选收集上清液以16500g，4℃超速离心30分钟，再收集上清液过滤后以100000g，4℃超速离心60分钟，得到沉淀为细胞外囊泡亚群一。
[0014]优选地，所述步骤4的超速离心优选收集上清液于160000g，4℃超速离心90分钟，再次得到沉淀为细胞外囊泡亚群二。
[0015]优选地，配制消化液时胶原酶II和脱氧核糖核酸酶I的体积比以及胶原酶IV和脱氧核糖核酸酶I的体积比为1：1。
[0016]优选地，所述步骤1酶解消化条件为37℃恒温摇床100
‑
400rpm消化20
‑
80分钟。
[0017]优选地，所述消化液中胶原酶II的浓度为2mg/mL，脱氧核糖核酸酶I的浓度为0.2mg/mL
[0018]优选地，所述消化液中胶原酶IV的浓度为2mg/mL，脱氧核糖核酸酶I的浓度为0.2mg/mL。
[0019]进一步优选地，所述细胞外囊泡亚群一和细胞外囊泡亚群二是两种完全独立的亚群。
[0020]本专利技术的有益效果如下：
[0021]本专利技术通过将胃癌组织浸入消化液中进行酶解消化，再经多次差速离心提取来分离提取胃癌组织来源的细胞外囊泡多种亚群，这种分离提取方法使用的两种酶成本低、试剂易获得、配制简单、品牌可选择范围广，而且在保证外囊泡数量和质量的基础上，极大降低了操作难度和成本，同时配制的消化液比其他消化液的提取效率高，对比现有技术中一种消化酶配方用于多种来源的组织，本专利技术能更加真实地反映胃癌组织来源细胞外囊泡的生物学功能和作用模式。
附图说明
[0022]为了更清楚地说明本专利技术的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0023]图1是实施例1
‑
2中不同消化液提取的细胞外囊泡亚群EV
‑
HD或EV...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种分离提取胃癌组织来源细胞外囊泡多种亚群的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1：将胃癌组织浸入配制的消化液中进行酶解消化过滤后得到组织消化上清液，所述消化液为胶原酶II和脱氧核糖核酸酶I的混合液，或胶原酶IV和脱氧核糖核酸酶I的混合液，所述消化液也可以是乙二胺四乙酸和二硫苏糖醇的混合液与胶原酶IV的组合溶液；步骤2：取步骤1的消化上清液以500g
‑
1000g，4℃离心10
‑
15分钟，再取离心后的上清液以3000g
‑
5000g，4℃离心15
‑
20分钟后收集上清液；步骤3：取步骤2收集的上清液再次以15000
‑
17000g，4℃超速离心15
‑
30分钟，并收集上清液过滤后再以50000
‑
120000g，4℃超速离心60
‑
100分钟，得到沉淀即为胃癌组织来源细胞外囊泡亚群一；步骤4：收集步骤3离心后的上清液于150000
‑
200000g，4℃超速离心60
‑
100分钟，再次得到沉淀为胃癌组织来源细胞外囊泡亚群二。2.根据权利要求1所述的分离提取胃癌组织来源细胞外囊泡多种亚群的方法，其特征在于，所述消化液为胶原酶II和脱氧核糖核酸酶I的混合液。3.根据权利要求1所述的分离提取胃癌组织来源细胞外囊泡多种亚群的方法，其特征在于，所述步骤2的超速离心为收集步骤1的上清液以500g，4℃离心10分钟，再取离心后的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张常华，霍明宇，张华奇，吴菁，邓存灿，
申请(专利权)人：中山大学附属第七医院深圳，
类型：发明
国别省市：