一种鱼类细胞体外三维培养、诱导分化和冷冻保存方法技术

本发明专利技术提出了一种鱼类细胞体外三维培养、诱导分化和冷冻保存方法。本发明专利技术包括以下步骤：1)取热可逆聚合物，添加于鱼类细胞溶剂中，于0

【技术实现步骤摘要】
一种鱼类细胞体外三维培养、诱导分化和冷冻保存方法


[0001]本专利技术涉及鱼类细胞3D培养的
，特别是指一种鱼类细胞体外三维培养、诱导分化和冷冻保存方法。

技术介绍

[0002]鱼类细胞的培养、诱导分化和冷冻保存一直是水产养殖业中的核心技术之一，其包含了鱼类常规细胞、生殖细胞和干细胞等，对于鱼类的育种、疾病防治和发育机制等研究具有重要的支持作用。中国专利CN102634481A于2012年8月15日公开了一种金钱鱼肾细胞体外培养方法，这种培养方法包括以下步骤：
[0003](1)配置L
‑
15基础培养基、原代培养基、含bFGF的原代培养基和传代培养基；(2)金钱鱼肾细胞原代培养：a、无菌取肾；b、消化分离肾细胞；c、接种；(3)金钱鱼肾细胞传代培养。这种培养方法对已有的海水鱼细胞培养方法进行借鉴和改良，摸索了适合金钱鱼肾细胞培养的培养方法，建立了稳定的肾细胞培养体系，首次建立了金钱鱼肾细胞系，以期为金钱鱼渗透压调节提供细胞模型，同时有助于金钱鱼功能基因组的深入研究；但是，这种鱼类细胞的培养方法依然延续了哺乳动物细胞的2D培养方式，无法实现在体外模拟鱼类细胞生长的真实微环境，进而影响最终评价指标的准确性。
[0004]目前，哺乳动物的细胞培养已经取得了长足进步，包含2D、3D和4D培养在内的多种培养体系已经成功建立，并被应用于细胞的深入研究中。水凝胶是一种聚合物与水分子构成的三维网络结构体系，其与生物体的细胞外基质具有极高的相似性。水凝胶内部丰富的孔径结构能够为细胞营养物质和代谢废物的传递提供充足的空间，是一种理想的细胞培养体系。例如：中国专利CN113699094A公开了一种无血清培养细胞的方法，这种方法依次包括如下步骤：(1)通过细胞计数板或细胞计数仪测定预培养细胞悬液中的细胞数，离心细胞悬液，细胞经离心聚集在离心管底部后，吸除上清液；(2)将生物材料水溶液与细胞混合，吹打细胞直至与生物材料水溶液混合均匀，细胞均匀分散在生物材料水溶液中形成生物材料包裹细胞的三维结构；(3)添加无血清细胞培养液浸没生物材料包裹细胞的三维结构，进行无血清培养细胞。这种生物材料包括天然生物材料或合成生物材料中的至少一种，天然生物材料包括壳聚糖及其衍生物、纤维素类材料、海藻酸盐及其衍生物、壳聚糖/甘油磷酸二钠混合物、淀粉类材料、血清白蛋白、明胶及其衍生物、鲱精蛋白、血纤蛋白原、胶原、肽类材料、木聚糖、透明质酸、鱼胶、角蛋白类、促凝血酶原激酶、还原角蛋白中的至少一种，合成生物材料包括聚氧乙烯
‑
聚乳酸羟基乙酸共聚物、结冷胶、丙烯酸、聚氨基酸、丙烯酸衍生物、聚乙烯醇、嵌段式聚合物、合成肽类材料中的至少一种。但是，这种生物材料的水溶液均为不可逆水凝胶，水凝胶制备完成之后，无法再次转变为液态，使得后期分离细胞成为难题。另外，由于哺乳动物的细胞培养条件与鱼类的细胞条件存在差异性，现有的这种哺乳动物的3D细胞培养方法无法实现鱼类细胞3D培养和分离。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种鱼类细胞体外三维培养、诱导分化和冷冻保存方法，旨在解决现有技术中鱼类细胞的培养方法仍停留在2D培养方式上使其无法实现在体外模拟鱼类细胞生长的真实微环境进而影响最终评价指标的准确性以及现有的哺乳动物3D细胞培养方法中生物材料水溶液为不可逆水凝胶导致后期细胞分离困难无法实现鱼类细胞3D培养和分离的问题。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0007]本专利技术的一种鱼类细胞体外三维培养、诱导分化和冷冻保存方法，包括以下步骤：1)取热可逆聚合物，添加于鱼类细胞溶剂中，于0
‑
13℃下，溶解0.5
‑
12h，得热可逆水凝胶，热可逆水凝胶的质量浓度为0.5
‑
15％；2)将步骤1)所得的热可逆水凝胶，在0
‑
13℃下，添加鱼类细胞，共混1
‑
5min，鱼类细胞的密度为102‑
106个/mL，升温至14
‑
38℃，得鱼类细胞三维培养水凝胶体系；3)在步骤2)所得的鱼类细胞三维培养水凝胶体系中添加完全培养基进行培养或诱导分化，或将步骤2)所得的鱼类细胞三维培养水凝胶体系进行冷冻保存。
[0008]本专利技术利用热可逆水凝胶通过物理交联形成了鱼类细胞三维培养水凝胶体系，实现了鱼类细胞在热可逆水凝胶中的三维培养、诱导分化和冷冻保存，这种热可逆水凝胶在低温下为可注射的液体形态而且升高温度之后变成固体水凝胶形态，这种鱼类细胞三维培养水凝胶体系的内部存在孔径结构，能够为鱼类细胞营养和代谢物质的交换、细胞迁移、增殖和分化提供充足的空间，将鱼类细胞三维培养水凝胶体系置于细胞完全培养基中持续培养，通过添加分化诱导剂还可以实现其细胞分化的定向调节，或者，或采用程序降温仪等专门的降温设施处理之后置于液氮中实现细胞的保种，最后，经过低温实现溶解，利用离心，可获得增殖、分化或保种的鱼类细胞。这种鱼类细胞体外三维培养、诱导分化和冷冻保存方法由于热可逆水凝胶的使用使得后期细胞分离容易，鱼类细胞在培养、诱导分化和冷冻保存过程中营养成分丰富，满足了鱼类细胞正常生长的需求，真正模拟了鱼类细胞在体外生长的真实微环境，而且，上述物理交联过程不会对鱼类细胞产生破坏作用，不影响鱼类细胞的增殖和分化，提高了最终评价指标的准确性，有效推动了水产养殖关键技术的长足进步。
[0009]作为一种优选的实施方案，所述步骤1)中，鱼类细胞溶剂为MEM、DMEM、Leibowitz L
‑
15和M199中的任意一种或几种。不同的溶剂是为了满足不同鱼类细胞的需要，鱼类细胞生长在其适宜的溶剂中，有利于鱼类细胞的正常生长。另外，本专利技术的溶剂还可以进一步添加血清、HEPES、青霉素、链霉素和FBS等活性成分形成完全培养基；优选地，添加活性成分为血清、HEPES和青霉素组合物，进一步地，用于鱼类细胞诱导分化的试剂需要在鱼类细胞完全培养基即溶剂、血清、HEPES和青霉素基础上，加入对应的细胞诱导分化因子，即诱导剂；用于鱼类细胞冷冻保存的冷冻保存剂除了上述溶剂、血清、HEPES和青霉素之外，还需要添加DMSO，以降低冷冻过程对于鱼类细胞的伤害。
[0010]作为一种优选的实施方案，所述鱼类细胞溶剂为DMEM和Leibowitz L
‑
15按照体积比为70
‑
90:10
‑
30组成的混合物；或者，所述鱼类细胞溶剂为MEM和M119按照体积比为60
‑
85:15
‑
40组成的混合物。本专利技术的鱼类细胞不仅可以是淡水鱼细胞，还可以是海水鱼细胞，DMEM与Leibowitz L
‑
15组成的溶剂适合于海水鱼细胞，这种混合溶剂可以充分提供海水鱼细胞生长做必需的营养成分；MEM和M119组成的溶剂适合于淡水鱼细胞，这种混合溶剂可以充分提供淡水鱼细胞生长做必需的营养成分。
[0011]作为一种优选的实施方案，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鱼类细胞体外三维培养、诱导分化和冷冻保存方法，其特征在于，包括以下步骤：1)取热可逆聚合物，添加于鱼类细胞溶剂中，于0
‑
13℃下，溶解0.5
‑
12h，得热可逆水凝胶，热可逆水凝胶的质量浓度为0.5
‑
15％；2)将步骤1)所得的热可逆水凝胶，在0
‑
13℃下，添加鱼类细胞，共混1
‑
5min，鱼类细胞的密度为102‑
106个/mL，升温至14
‑
38℃，得鱼类细胞三维培养水凝胶体系；3)在步骤2)所得的鱼类细胞三维培养水凝胶体系中添加完全培养基进行培养或诱导分化，或将步骤2)所得的鱼类细胞三维培养水凝胶体系进行冷冻保存。2.根据权利要求1所述的鱼类细胞体外三维培养、诱导分化和冷冻保存方法，其特征在于：所述步骤1)中，鱼类细胞溶剂为MEM、DMEM、Leibowitz L
‑
15和M199中的任意一种或几种。3.根据权利要求2所述的鱼类细胞体外三维培养、诱导分化和冷冻保存方法，其特征在于：所述鱼类细胞溶剂为DMEM和Leibowitz L
‑
15按照体积比为70
‑
90:10
‑
30组成的混合物；或者，所述鱼类细胞溶剂为MEM和M119按照体积比为60
‑
85:15
‑
40组成的混合物。4.根据权利要求1所述的鱼类细胞体外三维培养、诱导分化和冷冻保存方法，其特征在于：所述热可逆水凝胶的凝胶化温度为14
‑
38℃，凝胶化时间为30
‑
200s。5.根据权利要求1所述的鱼类细胞体外三维培养、诱导分化和冷冻保存方法，其特征在于：所述热可逆聚合物的分子量为2
‑
1500KDa；优选地，所述热可逆聚合物的分子量为150
‑
80...

【专利技术属性】
技术研发人员：毕世超，袁世鹏，孙申杰，
申请(专利权)人：青岛海洋科学与技术国家实验室发展中心，
类型：发明
国别省市：