一种毛囊干细胞的培养方法技术

本发明专利技术公开了一种毛囊干细胞的培养方法，本发明专利技术的毛囊干细胞的培养方法包括以下步骤：将毛囊干细胞采用胰酶进行消化，然后在涂敷有功能剂的完全培养基中进行培养，最后采用酶和缓冲液进行消化提纯得到毛囊干细胞。本发明专利技术利用电子束对N

【技术实现步骤摘要】
一种毛囊干细胞的培养方法


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种毛囊干细胞的培养方法。

技术介绍

[0002]毛囊干细胞是成体干细胞的一种，毛囊是皮肤中重要的附属器官，毛囊上皮根鞘中的毛囊干细胞积极参与了创伤后皮肤的修复重建，可作为种子细胞参与组织工程皮肤的构建。相对胚胎干细胞和目前新兴起的诱导多能性干细胞来说，由于哺乳动物几乎所有体表都覆盖有毛囊，毛囊干细胞更容易从自身获得，不受伦理因素的制约，避免了异体干细胞移植带来的免疫排斥，因此具有很大的临床应用前景与价值。但是在体外培养过程中容易受到损伤，导致分选到的毛囊干细胞不易成活，克隆形成效率极低。随着毛囊干细胞的应用价值越来越受到人们的关注，如何获得大量的，质量稳定可控的毛囊干细胞成为人们致力研究的问题。
[0003]在培养皿上生长的细胞通常使用螯合剂(如乙二胺四乙酸)或蛋白水解酶来收获。但是无法增加细胞的扩增效率，而且细胞外基质、细胞膜蛋白和细胞连接容易被破坏。本专利技术通过研发出一种温度敏感的细胞培养皿功能剂，功能剂能与细胞培养皿进行良好的粘结，功能剂表面通过温度变化就可以无创地制备各种类型的细胞薄片。对于治疗受损的人体组织和器官具有重大的意义。
[0004]中国专利CN113502259A公开了一种毛囊干细胞的分离培养方法。该毛囊干细胞的分离方法包括：S1、进行毛囊的显微剥离得到毛囊；S2、在完全培养基中培养毛囊，经过纯化后得到毛囊干细胞；所述完全培养基包括基础培养基、表皮生长因子、胰岛素、氢化可的松、L
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谷酰胺、维生素A、维生素D2、转铁蛋白、亚油酸、牛血清白蛋白和胎牛血清。该专利技术中制备毛囊干细胞所需要的皮肤材料少，只用几根毛囊甚至一根即可；开始时细胞在其原来的微环境中生长，对细胞损伤小，克隆形成效率高；且能够稳定传代，可以获得足量毛囊干细胞。但是该专利存在毛囊干细胞生长受限，传代稳定性差的缺点。
[0005]公开号为CN102344906A的专利技术专利公开一种毛囊干细胞的分离培养方法。该专利技术提供的方法是利用器官培养的方法，采用William
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s E完全培养基对毛囊进行培养并分离纯化出毛囊干细胞。该专利技术仅用很小的皮肤材料，通过显微剥离技术，在体视镜下剥离出大鼠触须毛囊，然后对整个触须毛囊进行培养，毛囊干细胞从隆突部长出并形成克隆，此细胞的克隆形成效率高，易纯化，能长期传代并保持毛囊干细胞特性不变，用一根触须毛囊就能获得可以长期使用的足量的毛囊干细胞。但是该方法制备的毛囊干细胞提取纯度低，增值过程中贴壁细胞少，增值速率慢。

技术实现思路

[0006]有鉴于现有技术中毛囊干细胞提取纯度低、贴壁细胞少、增殖速率慢、传代稳定性差的缺点，本专利技术采用功能剂涂敷培养皿的方式构造一种毛囊干细胞的培养方法，增强细胞活性，提高了毛囊干细胞的再生能力，提高传代稳定性。
[0007]为实现上述目的，本专利技术提供了一种毛囊干细胞的培养方法，包括以下步骤：
[0008]步骤1、消化：将毛囊干细胞置入消化酶A中，在35～38℃消化0.5～2h，加入终止液终止消化，600～1000rpm离心3～8min，收集消化毛囊干细胞；
[0009]步骤2、培养：将功能剂均匀涂敷在完全培养基的内表面，涂敷量为5～2mg/cm2，将步骤1制备的消化毛囊干细胞接种于完全培养基中，接种浓度为5
×
103个/mL，培养温度为36～37℃、CO2浓度为4.5～5.5％，每1～2天换液一次，总共培养8～15天，得到培育毛囊干细胞；
[0010]步骤3、纯化：在22～28℃的条件下，用消化酶A将步骤2制备的培育毛囊干细胞消化0.5～2h，吹打成单细胞悬液接种于完全培养基中，再用消化酶B在4～10℃下消化5～15h，消化后用缓冲液收集消化下来的毛囊干细胞。
[0011]优选的，所述毛囊干细胞取自鼠脑后枕部，在解剖显微镜下采用显微手术剪剪下毛囊外根鞘隆突部，采用PBS液冲洗1～3次。
[0012]优选的，所述终止液为胎牛血清。
[0013]优选的，所述完全培养基包括以下组分：40～45mL DMEM培养基、1～10μg/mL胰岛素，1～100ng/mL EGF，1～100ng/mL FGF、1～100ng/mL VEGF
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A、1～20ng/mL氢化可的松、0.05～0.2μg/mL维生素A、0.5～2μg/mL维生素D2、1～5mmol/L谷氨酰胺、20～40ng/mL氨基酸、50～200μL青霉素、50～200μL链霉素、2550μL羟基乙醇、10～40μg/mL牛血清白蛋白、体积百分含量14～16％的胎牛血清。
[0014]EGF，表皮细胞生长因子，是人体内分泌的一种重要细胞生长因子，有很强的生理活性。
[0015]FGF，成纤维细胞生长因子，促进内皮细胞的游走和平滑肌细胞的增殖，不能使平滑肌细胞游走。能够促进新血管形成，修复损害的内皮细胞。FGF被认为是病灶形成促进因子，但从修复角度看它也有有利的一面。
[0016]VEGF
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A，血管内皮生长因子A，是一种高度特异性的促血管内皮细胞生长因子，具有促进血管通透性增加、细胞外基质变性、血管内皮细胞迁移、增殖和血管形成等作用。
[0017]优选的，所述消化酶A为胰蛋白酶，用量为0.08～0.2vt％，消化酶B为Dispase酶，用量为0.2～0.3vt％。
[0018]优选的，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，采用35～45重量份磷酸二氢钠和3～8重量份磷酸氢二钠加水配置成800～1200mL溶液制备而成。
[0019]毛囊干细胞是一类存在于毛囊外根鞘隆突部的干细胞，具有未分化性、自我更新和体外增殖能力强等特点。体外培养研究中的毛囊干细胞表现出高克隆形成能力，具有很高的再生潜能。由于毛囊干细胞来源于毛发，可以直接从人体自身取得，数量极其丰富，且没有任何并发症，对人完全无创，现已成为皮肤组织工程学研究的焦点。
[0020]实现毛囊干细胞体外扩增和长期的分化性能，需要克服毛囊干细胞体外培养时传代代数短、细胞分化严重等问题。本专利技术采用的毛囊干细胞的培养方法能大幅提高毛囊干细胞体外培养的细胞数目并且有效维持毛囊干细胞的分化潜能。通过利用获取的毛囊干细胞，进行分离、培养、纯化后，能够利用细胞增殖获得大量的毛囊干细胞，以弥补毛囊干细胞不足的问题。
[0021]优选的，所述功能剂的制备方法如下，所述份数均为重量份：
[0022]S1、将1～3份N
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异丙基丙烯酰胺在空气中进行电子束辐照处理，电子束发生器的加速电压为0.8～1.2MeV，束流为80～120mA，直到吸收剂量为30～50kGy后停止，加水配置成30～50mmol/L的N
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异丙基丙烯酰胺水溶液，转移到冰水浴中继续进行辐照，直到总吸收剂量为70～90kGy后停止，得到辐照N
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异丙基丙烯酰胺，在
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10～
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种毛囊干细胞的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、消化：将毛囊干细胞置入消化酶A中，在35～38℃消化0.5～2h，加入终止液终止消化，600～1000rpm离心3～8min，收集消化毛囊干细胞；步骤2、培养：将功能剂均匀涂敷在完全培养基的内表面，涂敷量为5～2mg/cm2，将步骤1制备的消化毛囊干细胞接种于完全培养基中，接种浓度为5
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103个/mL，培养温度为36～37℃、CO2浓度为4.5～5.5％，每1～2天换液一次，总共培养8～15天，得到培育毛囊干细胞；步骤3、纯化：在22～28℃的条件下，用消化酶A将步骤2制备的培育毛囊干细胞消化0.5～2h，吹打成单细胞悬液接种于完全培养基中，再用消化酶B在4～10℃下消化5～15h，消化后用缓冲液收集消化下来的毛囊干细胞。2.根据权利要求1所述的一种毛囊干细胞的培养方法，其特征在于：所述毛囊干细胞取自鼠脑后枕部，在解剖显微镜下采用显微手术剪剪下毛囊外根鞘隆突部，采用PBS液冲洗1～3次。3.根据权利要求1所述的一种毛囊干细胞的培养方法，其特征在于，所述完全培养基包括以下组分：40～45mL DMEM培养基、1～10μg/mL胰岛素，1～100ng/mL EGF，1～100ng/mL FGF、1～100ng/mL VEGF
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A、1～20ng/mL氢化可的松、0.05～0.2μg/mL维生素A、0.5～2μg/mL维生素D2、1～5mmol/L谷氨酰胺、20～40ng/mL氨基酸、50～200μL青霉素、50～200μL链霉素、25～50μL羟基乙醇、10～40μg/mL牛血清白蛋白、体积百分含量14～16％的胎牛血清。4.根据权利要求1所述的一种毛囊干细胞的培养方法，其特征在于：所述消化酶A为胰蛋白酶，用量为0.08～0.2vt％；消化酶B为Dispase酶，用量为0.2～0...

【专利技术属性】
技术研发人员：李会民，
申请(专利权)人：北京熙朵医疗美容门诊部有限公司，
类型：发明
国别省市：