一种LMH悬浮细胞复苏培养方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种LMH悬浮细胞复苏培养方法及其应用，S1、将储存有LMH悬浮细胞的冻存管从液氮中取出放入35～39℃恒温水浴锅中震荡温热2

【技术实现步骤摘要】
一种LMH悬浮细胞复苏培养方法及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，尤其涉及一种LMH悬浮细胞复苏培养方法及其应用。

技术介绍

[0002]禽I群腺病毒是家禽常见的感染病原体，呈世界性分布，目前发现所有年龄的家禽均易感，只是鉴于家禽的品种、年龄所形成的致病力不同。目前发现禽I群腺病毒对鸡具有强致病性，主要病变表现为包涵体肝炎及心包积液
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肝炎综合征，该病可直接引发养鸡场20～40天龄鸡只出现30％以上的死亡率，此外其临床上也常常与传染性支气管炎病毒，呼肠孤病毒，H9亚型禽流感病毒等并发感染，导致种蛋鸡出现明显呼吸道病，关节炎，及严重的产蛋下降及畸形蛋等问题。因此目前该病已经成为严重影响养鸡场生产性能的重大疫病之一。
[0003]现有技术对禽I群腺病毒灭活疫苗的制备多采用鸡胚成纤维细胞(CEF)、鸡胚肾细胞(CEK)、雏鸡肾细胞(CK)、鸡胚肝细胞(CEL)4种原代细胞分离和增殖病毒。但原代肝肾细胞制备繁琐、易污染、不易转染，且在制备细胞过程中易混入CEF，不利于实验操作。LMH细胞系是日本科学家Kitagawa等在1981年利用患肝细胞癌的白莱航鸡肝细胞经二乙基亚硝胺致突变培育而成，是一种可以持续传代的鸡肝癌细胞系。随着细胞培养技术的进步以及研发需要，LMH细胞已经逐渐成为使用频率十分频繁的细胞系之一。LMH细胞有已经从贴壁细胞到悬浮细胞培养的转换工艺。LMH呈典型上皮细胞特征，该细胞系保持了鸡肝细胞分化的大量表型特征，主要用于重组腺病毒的构建，在禽腺病毒疫苗的制备有广大的应用前景。
[0004]然而，LMH悬浮细胞系的复苏培养一直是个难题，常规的复苏方法很难获得稳定且细胞状态优异的LMH悬浮细胞，往往细胞勉强维持几天的状态就开始死亡。使得LMH悬浮细胞培养的放大的推广应用有所阻碍。

技术实现思路

[0005]本专利技术提供了一种LMH悬浮细胞复苏培养方法及其应用，以解决现有技术的上述问题。
[0006]本专利技术的方案是：
[0007]一种LMH悬浮细胞复苏培养方法，包括下列步骤：
[0008]S1、将储存有LMH悬浮细胞的冻存管从液氮中取出放入35～39℃恒温水浴锅中震荡温热2
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3min；
[0009]S2、将细胞液体与LMH细胞培养基混合加入到离心管中；
[0010]S3、将S2中液体3min离心去上清；
[0011]S4、将LMH细胞培养基预热5min，用5ml的LMH细胞培养基重悬并转移至摇瓶，添加15mlLMH细胞培养基；
[0012]S5、取样计数，保证复苏后LMH悬浮细胞密度；
[0013]S6、将摇瓶置于摇床培养两天，计数，细胞复苏完成。
[0014]作为优选的技术方案，步骤S1中解冻融化的LMH悬浮细胞的冻存管为3支。
[0015]作为优选的技术方案，步骤S1中复苏温度为37℃。
[0016]作为优选的技术方案，步骤S2中所述细胞液体与LMH细胞培养基混合比例为1:3。
[0017]作为优选的技术方案，步骤S3中所述离心条件为1000rpm。
[0018]作为优选的技术方案，步骤S4中所述LMH细胞培养基预热条件是37摄氏度。
[0019]作为优选的技术方案，步骤S5中所述复苏后LMH悬浮细胞密度≥2E6。本专利技术发现LMH悬浮细胞的最低复苏密度为2E6，当细胞复苏密度低于2E6时无法完成复苏，LMH悬浮细胞复苏具有密度依赖性。
[0020]作为优选的技术方案，步骤S5中所述复苏后LMH悬浮细胞密度＞2E7。
[0021]作为优选的技术方案，步骤S6中摇瓶置于摇床的细胞培养条件为37℃，8％CO2，120rpm。
[0022]一种LMH悬浮细胞复苏培养方法的应用。
[0023]由于采用了上述技术方案一种LMH悬浮细胞复苏培养方法及其应用，S1、将储存有LMH悬浮细胞的冻存管从液氮中取出放入35～39℃恒温水浴锅中震荡温热2
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3min；S2、将细胞液体与LMH细胞培养基混合加入到离心管中；S3、将S2中液体3min离心去上清；S4、将LMH细胞培养基预热5min，用5ml的LMH细胞培养基重悬并转移至摇瓶，添加15mlLMH细胞培养基；S5、取样计数，保证复苏后LMH悬浮细胞密度；S6、将摇瓶置于摇床培养两天，计数，细胞复苏完成。
[0024]本专利技术与现有技术相对，具有以下的优点和效果：
[0025]1、本专利技术发现了LMH悬浮细胞复苏需要的最低细胞培养密度，比较常规复苏的操作，更有效的提高了复苏成功率，细胞活率和细胞状态。
[0026]2、本专利技术发现了LMH悬浮细胞对DMSO十分敏感，去除DMSO，如何去除DMSO不影响细胞复苏，是操作的关键步骤。
[0027]所述离心条件为1000rpm,3min。目前最常见和稳定的细胞冻存保护剂为DMSO，常规认为当DMSO浓度小于0.1％，对细胞毒性可以忽略，不影响细胞复苏状态，但是在研究中发现，LMH悬浮细胞对DMSO十分敏感，DMSO的去除对LMH细胞复苏十分重要。同时在细胞刚复苏的细胞离心转速高低关系到是否对细胞形成损伤，离心时间长短也影响细胞状态。1000rpm，3min离心去除DMSO最适合LMH悬浮细胞的复苏。
附图说明
[0028]图1为采用传统复苏方法的复苏效果图；
[0029]图2为采用本专利技术复苏方法的复苏效果图；
[0030]图3为采用本专利技术与常规复苏方法的细胞密度对比图；
[0031]图4为采用本专利技术与常规复苏方法的细胞活率对比图。
具体实施方式
[0032]为了弥补以上不足，本专利技术提供了一种LMH悬浮细胞复苏培养方法及其应用以解决上述
技术介绍
中的问题。
[0033]一种LMH悬浮细胞复苏培养方法，包括下列步骤：
[0034]S1、将储存有LMH悬浮细胞的冻存管从液氮中取出放入35～39℃恒温水浴锅中震荡温热2
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3min；
[0035]S2、将细胞液体与LMH细胞培养基混合加入到离心管中；
[0036]S3、将S2中液体3min离心去上清；
[0037]S4、将LMH细胞培养基预热5min，用5ml的LMH细胞培养基重悬并转移至摇瓶，添加15mlLMH细胞培养基；
[0038]S5、取样计数，保证复苏后LMH悬浮细胞密度；
[0039]S6、将摇瓶置于摇床培养两天，计数，细胞复苏完成。
[0040]作为优选的技术方案，步骤S1中解冻融化的LMH悬浮细胞的冻存管为3支。
[0041]步骤S1中复苏温度为37℃。
[0042]步骤S2中所述细胞液体与LMH细胞培养基混合比例为1:3。
[0043]步骤S3中所述离心条件为1000rpm。
[0044]步骤S4中所述LMH细胞培养基预热条件是37摄氏度。
[0045]步骤S5中所述复苏后LM本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种LMH悬浮细胞复苏培养方法，其特征在于，包括下列步骤：S1、将储存有LMH悬浮细胞的冻存管从液氮中取出放入35～39℃恒温水浴锅中震荡温热2
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3min；S2、将细胞液体与LMH细胞培养基混合加入到离心管中；S3、将S2中液体3min离心去上清；S4、将LMH细胞培养基预热5min，用5ml的LMH细胞培养基重悬并转移至摇瓶，添加15mlLMH细胞培养基；S5、取样计数，保证复苏后LMH悬浮细胞密度；S6、将摇瓶置于摇床培养两天，计数，细胞复苏完成。2.如权利要去1所述的LMH悬浮细胞复苏培养方法，其特征在于：步骤S1中解冻融化的LMH悬浮细胞的冻存管为3支。3.如权利要求1所述的LMH悬浮细胞复苏培养方法，其特征在于：步骤S1中复苏温度为37℃。4.如权利要求2所述的LMH悬浮细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：王龙，姚芸，王猛，
申请(专利权)人：无锡多宁生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：