一种促进糖尿病创面愈合的自噬小体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种促进糖尿病创面愈合的自噬小体及其制备方法和应用，属于生物医药技术领域。本发明专利技术提供了所述自噬小体的制备方法，从饥饿处理的血管内皮细胞中提取所述自噬小体，所述自噬小体的产生无需额外的试剂进行诱导，且提取条件简单，不需要超高速离心机，在普通的实验室即可实验，且产量高于外泌体，为患有慢性难愈性创面的患者提供了一种无毒副作用的，易于生成，价格低廉的治疗方法。本发明专利技术所述自噬小体能够促进糖尿病创面的愈合，减轻糖尿病创面对患者造成的生理及心理负担。糖尿病创面对患者造成的生理及心理负担。糖尿病创面对患者造成的生理及心理负担。

【技术实现步骤摘要】
一种促进糖尿病创面愈合的自噬小体及其制备方法和应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种促进糖尿病创面愈合的自噬小体及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]糖尿病是一种多层面的代谢异常，包括生化紊乱和表观遗传因素，最终转化为葡萄糖氧化过程的不可逆组织变化。腿部或足部溃疡是糖尿病患者最常见的并发症，约占糖尿病人群的19～34％。经典概念将糖尿病足定义为下肢深层组织损伤又被Armstrong称为“癌症类比”。这主要是由于足部溃疡和截肢相关的5年死亡率超过了常见癌症。而在全球大约50～70％的截肢是由于糖尿病创面。人们普遍认为，糖尿病创面的主要特征是持续的感染，成熟肉芽组织的形成和重塑受损。尽管近年来对糖尿病创伤愈合受损的认识有所进展，但其病理和分子机制仍不清楚，现有方法的治疗效果不尽如人意。
[0003]分泌型自噬小体(Secretoryautophagosomes，SAPs)是由分泌性自噬产生的，也属于细胞外囊泡(EVs)家族，是一种通过将货物转移到靶细胞的细胞间通信的新模式。暴露于压力，特别是饥饿，可以通过诱导溶酶体完整性的丧失来增强分泌性自噬和减少降解性自噬。近年来对SAPs的研究主要集中在阐明其在癌症和急性呼吸窘迫综合征等疾病的发生和发展中的作用，但是其在疾病中的治疗作用一直未被重视。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于提供一种促进糖尿病创面愈合的自噬小体及其制备方法和应用，提高自噬小体在糖尿病创面中的愈合效果。
[0005]本专利技术提供了一种促进糖尿病创面愈合的自噬小体的制备方法，包括如下步骤：在无血清培养基中培养血管内皮细胞，对细胞培养液进行第一离心，收集第一上清液，对所述第一上清液进行第二离心，沉淀中含所述自噬小体；
[0006]所述第一离心的离心力为2000g，时间为10分钟；
[0007]所述第二离心的离心力为12000g，时间为15分钟。
[0008]优选的，所述无血清培养基包括含有0.1％青链霉素(PS)的Gibco高糖DMEM培养基。
[0009]优选的，在所述无血清培养基中培养血管内皮细胞的时间为48小时。
[0010]优选的，所述第一离心和第二离心的温度均为4℃。
[0011]优选的，收集所述沉淀后，还包括利用LC3标记磁珠与所述沉淀进行孵育，捕获自噬小体。
[0012]本专利技术还提供了根据上述制备方法得到的自噬小体。
[0013]本专利技术还提供了上述自噬小体在制备促进糖尿病创面愈合的药物中的应用。
[0014]有益效果：本专利技术提供了一种促进糖尿病创面愈合的自噬小体的制备方法，从饥饿处理的血管内皮细胞中提取所述自噬小体，所述自噬小体的产生无需额外的试剂进行诱
导，且提取条件简单，不需要超高速离心机，在普通的实验室即可实验，且产量高于外泌体，为患有慢性难愈性创面的患者提供了一种无毒副作用的，易于生成，价格低廉的治疗方法。本专利技术所述自噬小体能够促进糖尿病创面的愈合，减轻糖尿病创面对患者造成的生理及心理负担。
附图说明
[0015]图1为本专利技术实施例2中血管内皮细胞中级血管内皮细胞提取的自噬小体中的LC3蛋白的表达情况及纳米粒子分析结果图；
[0016]图2为本专利技术实施例2中自噬小体的纳米粒子分析结果；
[0017]图3为本专利技术实施例2中自噬小体的透射电镜图；
[0018]图4为本专利技术实施例2中自噬小体对糖尿病小鼠创面的治疗效果的大体创面图；
[0019]图5为本专利技术实施例2中自噬小体对糖尿病小鼠创面的治疗效果的愈合轨迹图。
具体实施方式
[0020]本专利技术提供了一种促进糖尿病创面愈合的自噬小体的制备方法，包括如下步骤：在无血清培养基中培养血管内皮细胞，对细胞培养液进行第一离心，收集第一上清液，对所述第一上清液进行第二离心，沉淀中含所述自噬小体；
[0021]所述第一离心的离心力为2000g，时间为10分钟；
[0022]所述第二离心的离心力为12000g，时间为15分钟。
[0023]本专利技术利用无血清培养基培养血管内皮细胞，所述无血清培养基优选为含有0.1％青链霉素(PS)的Gibco高糖DMEM培养基。本专利技术优选在所述无血清培养基中培养血管内皮细胞48小时。利用本专利技术所述无血清培养基，不提供胎牛血清使血管内皮细胞处于饥饿状态，从而促进分泌型自噬小体的发生。
[0024]本专利技术优选对细胞培养液进行第一离心，所述第一离心包括采用低速离心的方法去除大颗粒物质，保留上清。本专利技术所述第一离心期间保持低温，如4℃。本专利技术对第一离心液进行第二离心，收集沉淀，且在所述第二离心期间同样保持低温。本专利技术优选进行两次所述第二离心，期间用PBS重悬，利用高速离心可得到粗提取的自噬小体。
[0025]本专利技术在收集所述沉淀后，优选还包括利用LC3标记磁珠与所述沉淀进行孵育，捕获自噬小体。实施例中优选使用活化的proteinA磁珠首先与LC3抗体共孵育，随后磁性分离，收集磁珠，并将其作用于上述收集的粗提取的自噬小体中，37℃共同孵育30min
‑
2h后，利用0.1MNaOH洗脱。
[0026]本专利技术还提供了根据上述制备方法得到的自噬小体。
[0027]利用上述制备方法，纯化后的自噬小体呈现经典双层膜样结构，整体呈现杯状形态，自噬小体的粒径大小为(415.8
±
69nm)和浓度并且自噬小体内LC3II的表达量明显高于细胞裂解液中LC3II的表达，而LC3I的表达明显减少，证实所提取的细胞外囊泡是外泌体。
[0028]本专利技术还提供了上述自噬小体在制备促进糖尿病创面愈合的药物中的应用。应用自噬小体能够明显促进糖尿病小鼠创面的愈合修复，促进上皮化及肉芽组织再生，在刺激皮肤附属器再生和提升愈合质量方面具有更大应用潜力。
[0029]为了进一步说明本专利技术，下面结合附图和实施例对本专利技术提供的一种促进糖尿病创面愈合的自噬小体及其制备方法和应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本专利技术保护范围的限定。
[0030]实施例1
[0031]促进糖尿病创面愈合的自噬小体的制备
[0032]1.设置饥饿环境为仅含5％的PS的Gibco高糖DMEM培养基。
[0033]2.在无血清环境中培养血管内皮细胞，并在48小时后，收集培养基，在离心机中2000rmp低速离心10分钟，去除大颗粒物质(死细胞和碎片等)，收集上清继续离心(4℃，12000g，15min)，弃上清后，PBS重悬后离心(4℃，12000g，15min)获得粗提取的自噬小体。
[0034]3.随后将proteinA磁珠与LC3抗体共孵育，随后磁性分离，收集磁珠，并将其作用于上述收集的粗提取的自噬小体中，通过抗原抗体的相互作用纯化自噬小体。
[0035]4.无菌PBS重悬沉淀获取自噬小体。可现用或者冻存以备后期使用。
[0036]实施例2
[0037]本实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种促进糖尿病创面愈合的自噬小体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：在无血清培养基中培养血管内皮细胞，对细胞培养液进行第一离心，收集第一上清液，对所述第一上清液进行第二离心，沉淀中含所述自噬小体；所述第一离心的离心力为2000g，时间为10分钟；所述第二离心的离心力为12000g，时间为15分钟。2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述无血清培养基包括含有0.1％青链霉素的Gibco高糖DMEM培养基。3.根...

【专利技术属性】
技术研发人员：张翠萍，崔胜楠，刘熹，马奎，付小兵，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：