用于AAV病毒包装用的辅助质粒载体、其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种辅助质粒载体、其制备方法和应用，所述的辅助质粒载体含有SV40复制起始位点(SV40origin of replication，SV40ori)序列，上述辅助质粒载体可显著增强真核表达效果，提高包装病毒滴度，有助于增加rAAV载体的治疗价值。治疗价值。治疗价值。

【技术实现步骤摘要】
用于AAV病毒包装用的辅助质粒载体、其构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及基因与细胞治疗药物载体
，具体涉及用于腺相关病毒(AAV)包装的可提高病毒滴度的辅助质粒载体、其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]腺相关病毒(Adeno
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associated virus,AAV)是一种单链DNA、无包膜、二十面体的病毒，属于依赖细小病毒属。AAV对人无致病性，它们最初被发现是腺病毒制剂的污染物，需要与腺病毒或疱疹病毒共感染才能有效复制。AAV病毒的包装目前最常用的是AAV无辅助病毒系统(AAV Helper
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Free System)，可以在无辅助病毒的条件下生产重组腺相关病毒，这种系统为AAV生产细胞与三个质粒的共转染，三个质粒分别为带有AAV ITR的载有目的基因的穿梭质粒、带有Rep
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Cap的表达不同血清型的包装质粒、提供从腺病毒分离的辅助基因(如E2A、E4等)的辅助质粒。AAV包装的基因组删除了全部AAV蛋白编码序列基因，添加了治疗性基因表达盒，基因组的两端序列是ITR为反向重复序列，为AAV包装所必需，在载体生产过程中指导基因组复制，这使得重组AAV(rAAV)的包装能力最大化，rAAV基因组整合到人细胞中的几率大大减少，有助于在体内递送时的低免疫原性和细胞毒性。一些人类疾病的基因治疗方法正在利用重组AAV(rAAV)载体开发生物制剂。
[0003]然而该病毒载体的商业化生产过程非常困难，难以获得较高的病毒载体生产效率，极大地提高了该病毒载体的生产成本。通过改造重组质粒结构，提高病毒包装滴度，对于增强其应用至关重要。

技术实现思路

[0004]为克服上述缺陷，本专利技术利用SV40 ori作为强启动元件，提供一种可提高病毒包装滴度的用于AAV包装的辅助质粒载体、其构建方法和应用。具体的：
[0005]本专利技术第一方面，提供一种辅助质粒载体，所述的辅助质粒载体含有SV40复制起始位点(SV40 origin of replication，SV40 ori)序列。
[0006]优选的，所述SV40 ori序列与SEQ ID NO：1第1
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136位所示序列具有至少90％的同一性，例如，至少具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％的同一性，更为优选的，所述SV40 ori序列如SEQ ID NO：1第1
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136位所示。
[0007]优选的，所述辅助质粒载体还包括筛选用的抗性基因，例如：新霉素磷酸转移酶基因(npt)、卡那霉素抗性基因(nptII)、硫酸卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因，氯霉素抗性基因、四环素抗性基因等等。更优选的，所述抗性基因是硫酸卡那霉素抗性基因。
[0008]更优选的，所述硫酸卡那霉素抗性基因与SEQ ID NO：1第950
‑
1744位所示序列具有至少90％的同一性，例如，至少具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％的同一性，进一步优选的，所述硫酸卡那霉素抗性基因序列如SEQ ID NO：1第950
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1744位所示。
[0009]在一个具体的实施方式中，所述包含硫酸卡那霉素抗性基因和SV40 ori序列的核
苷酸序列与SEQ ID NO：1所示序列具有至少90％的同一性，例如，至少具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％的同一性，更为优选的，所述包含硫酸卡那霉素抗性基因和SV40 ori序列的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0010]优选的，所述辅助质粒载体还包括E4、E2A、VA基因。
[0011]本专利技术第二方面，提供一种辅助质粒载体的构建方法，所述构建方法包括：将SV40 ori插入到辅助质粒中。
[0012]优选的，所述SV40 ori序列与SEQ ID NO：1第1
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136位所示序列具有至少90％的同一性，例如，至少具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％的同一性，更为优选的，所述SV40 ori序列如SEQ ID NO：1第1
‑
136位所示。
[0013]优选的，所述构建方法包括(1)、从骨架质粒中扩增SV40 ori序列片段，酶切获得SV40ori序列片段；(2)酶切辅助质粒；(3)连接转化，将步骤(1)和(2)的片段以DNA连接酶连接，转化感受态宿主细胞，构建获得包含SV40 ori序列的辅助质粒载体。
[0014]更优选的，所述构建方法步骤(1)中的扩增引物序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。
[0015]更优选的，所述构建方法步骤(2)中获得包含硫酸卡那霉素抗性基因和SV40 ori序列的片段，所述步骤(3)中利用硫酸卡那霉素筛选。进一步优选的，所述硫酸卡那霉素抗性基因与SEQ ID NO：1第950
‑
1744位所示序列具有至少90％的同一性，例如，至少具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％的同一性，更为优选的，所述硫酸卡那霉素抗性基因序列如SEQ ID NO：1第950
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1744位所示。
[0016]在一个具体的实施方式中，所述包含硫酸卡那霉素抗性基因和SV40 ori序列的核苷酸序列与SEQ ID NO：1所示序列具有至少90％的同一性，例如，至少具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％的同一性，更为优选的，所述硫酸卡那霉素抗性基因和SV40 ori序列如SEQ ID NO：1所示。
[0017]本专利技术第三方面，提供一种上述辅助质粒载体在重组腺相关病毒包装中的用途。
[0018]本专利技术第四方面，提供一种重组腺相关病毒，所述重组腺相关病毒包括上述辅助质粒载体。
[0019]优选的，所述重组腺相关病毒为任意血清型重组腺相关病毒，例如AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9等等。
[0020]本专利技术第五方面，提供一种重组腺相关病毒的制备方法，所述制备方法包括：将上述辅助质粒载体、穿梭质粒和包装质粒共转染到宿主细胞。
[0021]优选的，所述穿梭质粒包括报告基因，更优选的，所述报告基因选自CAT、hGH、SEAP、RFP、GFP或eGFP、β
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Gal或萤火虫荧光素酶基因。
[0022]优选的，所述包装质粒包括Rep和Cap基因。
[0023]优选的，所述宿主细胞包括任意的表达SV40病毒T抗原的细胞；例如：大肠杆菌、酵母菌、HEK293、HEK本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种辅助质粒载体，其特征在于，所述的辅助质粒载体含有SV40复制起始位点(SV40 origin of replication，SV40 ori)序列。2.根据权利要求1所述的辅助质粒载体，其特征在于，所述SV40 ori序列与SEQ ID NO：1第1
‑
136位所示序列具有至少90％的同一性。3.根据权利要求1
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2任一所述的辅助质粒载体，其特征在于，所述辅助质粒载体还包括抗性基因。4.根据权利要求1
‑
3任一所述的辅助质粒载体，其特征在于，所述辅助质粒载体还包括E4、E2A、VA基因。5.一种权利要求1
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4任一所述辅助质粒载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括：将SV40 ori插入到辅...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙秀莲，
申请(专利权)人：济南宜明医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：