三螺旋束蛋白的亲和配体文库及其用途制造技术

本公开涉及亲和色谱领域，并且更具体地涉及提供编码三螺旋束蛋白质结构域的核酸和多肽文库，其适用于选择特异性结合感兴趣的靶分子的亲和配体。本公开还涉及使用那些文库来鉴定和分离此类针对靶分子的亲和配体的方法。定和分离此类针对靶分子的亲和配体的方法。定和分离此类针对靶分子的亲和配体的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】三螺旋束蛋白的亲和配体文库及其用途
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年10月13日提交的临时申请美国序列号63/091,201和2021年5月13日提交的美国序列号63/188,229的权益，所述申请各自以引用方式整体并入本文。


[0003]本公开涉及亲和色谱领域，并且更具体地涉及提供编码三螺旋束蛋白质结构域的核酸和多肽文库，其适用于选择特异性结合感兴趣的靶分子的亲和配体。本公开还涉及使用那些文库来鉴定和分离此类针对靶分子的亲和配体的方法。

技术介绍

[0004]生物产生的治疗剂的纯度受到当局的严格审查和监管，以确保安全性和有效性。因此，仍然需要有效纯化生物产生的治疗剂至高纯度的手段。
[0005]生物过程亲和色谱提供了一种通过几个步骤或单个步骤分离和纯化蛋白质的手段。然而，亲和配体的开发可能是资源密集型和耗时的。
[0006]为了促进亲和配体的发现，已经开发了亲和文库，可快速有效地筛选以鉴定感兴趣的靶标的配体。此类文库包括基于蛋白A结构域或Z结构域的可用于纯化免疫球蛋白的文库，以及基于抗体的以便在纯化过程中利用特定抗原
‑
抗体相互作用的文库。此外，能够产生高亲和力配体是产生用于生物过程纯化的亲和剂的另一个重要步骤。配体还应具有高稳定性，以承受生物加工的严酷条件，尤其是包含NaOH的原位清洗(CIP)方案。在许多纯化循环中重复使用树脂的能力对纯化过程的经济性具有深远的影响。基于蛋白A的IgG结合树脂的演变证明了这一点，现代变体能够承受重复的0.5M NaOH CIP循环。这些IgG结合结构域的特征在于与Fc区中CH2和CH3结构域的界面具有高结合亲和力，通常低于50nM(Graille等人(2000)Proc Natl Acad Sci USA.97:5399
‑
5404)。另外，还存在对没有IgG结合，但能够工程改造为与也具有高稳定性的其他模式的结合的亲和配体的需求。本公开解决了所述需求。考虑了可用作IgG以外的模式或分子的高亲和力配体的一系列多肽。
[0007]然而，已知许多其他多样结构的生物大分子具有多样的蛋白质
‑
配体相互作用机制，并且仍然需要找到这些大分子的亲和配体以利用生物过程亲和色谱提供的精简流程。
[0008]分子相互作用的多样性和机制是众所周知的(参见例如，Du等人(2016)Int.J.Mol.Sci.17.doi:10.3390/ijms17020144)。在生物大分子中遇到的一些蛋白质
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配体相互作用的结构多样性的实例示于图1中，并且这些模型强调了拥有大量具有不同配体结构的亲和文库的需求和优势。
[0009]此外，即使在已知的支架文库中，仍然需要拥有许多不同的文库。例如，在一项研究中，针对配体发现对48个不同的支架家族进行查询，并且62个最佳配体全部来自单一支架文库(48个支架文库中的支架45)。这一非凡的发现强调了对配体结构多样性的需求，而不仅仅是特定配体结构内的高序列多样性。有效处理支架家族之间的配体多样性是配体发现工作中的主要技术挑战。在进一步的工作中，62个配体之间的序列相似性允许将这些配
体分类为5个进化枝。虽然其他家族产生了约900个具有中等亲和力的配体，但这些配体缺乏与62个最佳配体相关的选择性。有趣的是，用于62个最佳配体的支架是为适应生物“锁和钥匙”亲和配体而开发的。来自其他支架类型的选择性配体的缺乏仅表明这种特定支架家族具有模拟同源受体所需的分子结构(Coyle等人在Approaches to the Purification,Analysis and Characterization of Antibody
‑
Based Therapeutics中,(编辑，Matte)Elsevier,2020,第55
‑
79页(在第65页)。
[0010]因此，亲和配体的稀缺以及文库之间的不同效用已经产生了对能够与代表多个配体
‑
靶标结构的许多不同类型结构相互作用的配体文库的需求。本文所述的文库是解决这些需求的策略的一部分。

技术实现思路

[0011]亲和配体文库可用作针对靶分子的新亲和配体的来源，其满足了对使用生物过程亲和色谱纯化那些靶标的简单且经济的方式的需求。
[0012]在一个方面，本公开提供了核酸文库，其成员编码亲和配体，所述亲和配体包含由下式表示的氨基酸序列，从N末端到C末端，
[0013][A]‑
X1QRRX2FIX3X4LRX5DPS
‑
[X6]n
‑
SAX7LLAX8AX9X
10
X
11
NDX 12
QAPX
13
‑
[B](SEQ ID NO.1)，
[0014]其中(a)[A]包含α
‑
螺旋形成肽结构域；
[0015](b)X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X8、X
10
、X
11
和X
12
中的每一个独立地是任何氨基酸；
[0016](c)n表示存在的X6残基的数量，并且是一到十的整数，
[0017](d)X9和X
13
中的每一个独立地是A、K或R；并且
[0018](e)[B]不存在，是VD，或者是包含以下氨基酸序列的肽结构域：
[0019]VDGQAGQGGGSGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(SEQ ID NO.9)、
[0020]GQAGQGGGSGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(SEQ ID NO.10)、
[0021]VDGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(SEQ ID NO.11)或
[0022]GLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(SEQ ID NO.12)。
[0023]在某些实施方案中，[A]的α
‑
螺旋形成肽结构域包含葡萄球菌蛋白A(SPA)结构域(诸如Z
‑
结构域、A
‑
结构域、B
‑
结构域、C
‑
结构域、D
‑
结构域或E
‑
结构域，并且在一些实施方案中优选Z
‑
结构域)的碱稳定螺旋1。在一些实施方案中，[A]包含具有以下氨基酸序列的肽：VDAKFDKELEEARAEIERLPNLTE(SEQ ID NO.2)、VDAKFDKEL EEARAKIERLPNLTE(SEQ ID NO.3)、VDAKFDKELEEVRAEIER LPNLTE(SEQ ID NO.4)、VDAKFEKELEEARAEIERLPNLTE(SE Q ID NO.5)、VDAKFDKELEEIRAEIERLPNLTE(SEQ ID NO.6)或VDAKFDKELEEARAEIER本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种核酸文库，其成员编码亲和配体，所述亲和配体包含由下式表示的氨基酸序列，从N末端到C末端，[A]
‑
X1QRRX2FIX3X4LRX5DPS
‑
[X6]
n
‑
SAX7LLAX8AX9X
10
X
11
NDX
12
QAPX
13
‑
[B](SEQ ID NO.1)，其中(a)[A]包含α
‑
螺旋形成肽结构域；(b)X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7、X
8、
X
10
、X
11
和X
12
中的每一个独立地是任何氨基酸；(c)n表示存在的X6残基的数量，并且是一到十的整数，(d)X9和X
13
中的每一个独立地是A、K或R；并且(e)[B]不存在，是VD，或者是包含以下氨基酸序列的肽结构域：VDGQAGQGGGSGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(SEQ ID NO.9)、GQAGQGGGSGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(SEQ ID NO.10)、VDGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(SEQ ID NO.11)或GLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(SEQ ID NO.12)。2.如权利要求1所述的核酸文库，其中所述α
‑
螺旋形成肽结构域包含在SPA Z
‑
结构域、A
‑
结构域、B
‑
结构域、C
‑
结构域、D
‑
结构域和E
‑
结构域中的任一个，并且优选Z
‑
结构域的残基5
‑
19处发现的葡萄球菌蛋白A(SPA)结构域的碱稳定螺旋1。3.如权利要求1或2所述的核酸文库，其中[A]包含具有以下氨基酸序列的肽：VDAKFDKELEEARAEIERLPNLTE(SEQ ID NO.2)、VDAKFDKELEEARAKIERLPNLTE(SEQ ID NO.3)、VDAKFDKELEEVRAEIERLPNLTE(SEQ ID NO.4)、VDAKFEKELEEARAEIERLPNLTE(SEQ ID NO.5)、VDAKFDKELEEIRAEIERLPNLTE(SEQ ID NO.6)或VDAKFDKELEEARAEIERLPALTE(SEQ ID NO.7)。4.如权利要求3所述的核酸文库，其中[A]的N末端之前是M或MAQGT(SEQ ID NO.8)。5.如权利要求1
‑
4中任一项所述的核酸文库，其包含肽标签，任选地，其中所述标签是血凝素、c
‑
myc、单纯疱疹病毒糖蛋白D、T7、GST、GFP、MBP、strep标签、His标签、Myc标签、TAP标签或FLAG标签。6.如权利要求1
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：B，
申请(专利权)人：艾维泰有限责任公司，
类型：发明
国别省市：