AAV2制造技术

本公开涉及色谱领域，并且更具体地涉及适用于分离腺相关病毒

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】AAV2亲和剂
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本
PCT
申请要求在
2021
年2月
19
日提交的美国临时申请号
63/151,622
的权益，其全部内容以引用的方式并入本文
。
专利

[0003]本公开涉及色谱领域，并且更具体地涉及适用于分离腺相关病毒
(AAV)
的新型亲和配体和亲和剂
。
因此，本公开涵盖亲和配体本身
、
包含根据本公开的亲和配体的色谱分离基质
(
亲和剂
)
，以及
AAV
分离，特别是
AAV
血清型
2(AAV2)
分离的过程，其中使用根据本公开的配体
。

技术介绍

[0004]生物产生的治疗剂的纯度受到当局的严格审查和监管，以确保安全性和有效性
。
因此，需要将生物产生的治疗剂高效纯化至高纯度
。
[0005]为了支持治疗性蛋白质的临床努力，需要从重组来源高效纯化蛋白质的组合物和方法
。
亲和纯化是一种通过几个步骤或单个步骤分离和
/
或获得所需蛋白质纯度的手段
。
然而，包含与固体支持物结合的亲和配体的分离基质的开发可能是资源密集且耗时的任务，并且因此仅存在针对极少数蛋白质的亲和分离基质
。
在不存在亲和分离基质的情况下，纯化通常涉及低效过程，诸如多柱过程
。
[0006]腺相关病毒
(AAV)
是细小病毒家族的成员，是一种小型无包膜病毒
。AAV
颗粒包含由
60
个衣壳蛋白亚基
VP1、VP2
和
VP3
构成的
AAV
衣壳，其中包含约
4.7
千碱基
(kb)
的单链
DNA
基因组
。
这些
VP1、VP2
和
VP3
蛋白以约
1:1:10
的预测比存在，并以二十面体对称排列
。
个别粒子仅包装一条
DNA
分子链，但这可能是正链或负链，两者都具有传染性
。
与大多数病毒不同，
AAV
天生无致病性
、
免疫原性差且具有广泛的嗜性
。
许多
AAV
血清型已被鉴定为具有可变嗜性
。AAV
的组织特异性由病毒衣壳血清型决定
。
这种特异性允许将感兴趣的基因靶向某些组织和细胞
。
非致病性
、
广泛的感染性宿主范围
(
包括非分裂细胞
)
和整合的特性使
AAV
血清型
(
诸如
AAV2)
成为一种有吸引力的媒介物
。
[0007]重组腺相关病毒
(rAAV)
是研究最多的用于递送人类基因治疗的病毒载体之一
。
重组
AAV
缺少病毒整合和复制的两个必需基因
。
因此，
rAAV
主要保持附加型，并且可在非分裂细胞中持续很长时间
。
由于这些特征以及靶向特定组织类型的能力，重组
AAV
已成为用于研究和基因治疗应用的主要病毒载体之一
。AAV
血清型表现出各种细胞嗜性和与细胞受体的相互作用，以允许进入细胞并将遗传物质递送到细胞核中进行表达
。rAAV
的制造既困难又昂贵
。
细胞培养生产力低，并且通常达到每升
10
13
–
10
15
个病毒衣壳，相当于大约
0.1
‑
10mg/L。
纯化主要通过使用亲和色谱完成，但只有少数亲和树脂可用于
AAV
的纯化，包括
POROS
TM CaptureSelect
TM AAV9、POROS
TM CaptureSelect
TM AAVX、POROS
TM CaptureSelect
TM AAV8
和
AVB Sepharose
，并且这些并不总是有选择性的，而且价格昂贵
。
而且，这些树脂有两大缺点，一是不能用氢氧化钠清洗，二是只能重复使用几个循环
。
这增加了树脂消耗并导致纯化
NO.41)、LPNLTEEQRRIFIESLRDDPSQ(SEQ ID NO.42)、LPNLTEEQRRTFIESLRDDPSQ(SEQ ID NO.43)、LPNLTEEQ RRAFIEPLRDDPSQ(SEQ ID NO.44)
或
LPNLTEEQRRAFIESLRD DPSQ(SEQ ID NO.45)
，并且优选是后者的序列
。
[0035]根据本公开，亲和配体的实施方案独立地包括任何和所有排列，其中配体的
N
末端之前是
M
或
MAQGT(SEQ ID NO.46)
，或者其中配体的
C
末端之后是
VD、VDGEKPEK(SEQ ID NO.47)、VDG LNDIFEAQKIEWHE(SEQ ID NO.48)、VDGLNDIFEAQKIEWHE HHHHHH(SEQ ID NO.49)
或
GQAGQGGGSGLNDIFEAQKIEWH EHHHHHH(SEQ ID NO.50)。
[0036]在某些实施方案中，亲和配体包含
SEQ ID NOS.3
‑
30、32
或
34
‑
37
中的任一项，并且优选包含
SEQ ID NO.30。
[0037]在再其他实施方案中，本公开的任何亲和配体还包含
C
末端半胱氨酸或赖氨酸
。
[0038]本公开的其他方面涉及包含多个根据本公开的亲和配体的多聚体
。
此类多聚体包括二聚体
、
三聚体
、
四聚体
、
五聚体
、
六聚体
、
七聚体
、
八聚体和九聚体
。
在一些实施方案中，多聚体的亲和配体包含
SEQ ID NO.30。
在一些实施方案中，多聚体包含
SEQ ID NO.31
或
33。
[0039]在本文所述的其他方面，本文所公开的亲和配体或多聚体还包含至少一种异源剂，其可操作地连接至所述亲和配体或多聚体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.
一种亲和配体，其包含三螺旋束蛋白，所述三螺旋束蛋白包含由下式表示的氨基酸序列，从
N
末端到
C
末端，
X5DX7X8LEX
11
ARX
14
X
15
IEX
18
‑
[Z]
‑
X
41
X
42
X
43
LLX
46
EAX
49
X
50
LNX 53
A(SEQ ID NO.51)
其中
X5是
W、Y、D、F、H、I
或
R
，优选
W
；
X7是
R、A、W、V、H、Y、T、D
或
Q
，优选
R
；
X8是
D、Q、E、I、T
或
N
，优选
D
；
X
11
是
F、I、S、Y、L、K、V、W
或
Q
，优选
F
；
X
14
是
E、D、H、K、S、N、G、A
或
V
，优选
E
；
X
15
是除
C
或
P
以外的任何氨基酸，优选
E
；
X
18
是除
C
或
P
以外的任何氨基酸，优选
R
；
X
41
是
H、Y、R
或
A
，优选
H
；
X
42
是
S、G、Q、T、F、W、A
或
N
，优选
Q
；
X
43
是
S、Q、F、Y、A
或
T
，优选
S
；
X
46
是
N、R、W、S、Q、G、T
或
Y
，优选
N
；
X
49
是
F、W、S、E、D、Y、N
或
T
，优选
S
；
X
50
是
Q、N、E、T、R
或
F
，优选
Q
；
X
53
是
L、G、H、T、A、V、F、Y、E
或
I
，优选
L
；
[Z]
是
α
‑
螺旋形成肽结构域，并且优选是
LPNLTEEQRRAFIESL RDDPSQ
；并且所述亲和配体特异性地与腺相关病毒亚型
2(AAV2)
颗粒或衣壳或
AAV2
颗粒或衣壳的变体相互作用
。2.
如权利要求1所述的亲和配体，其中所述式是以下中的任一项：
VDAKX5DX7X8LEX
11
ARX
14
X
15
IEX
18
‑
[Z]
‑
X
41
X
42
X
43
LLX
46
EAX
49
X
50
LNX
53
AQAPK,VDAKX5DX7X8LEX
11
ARX
14
X
15
IEX
18
‑
[Z]
‑
X
41
X
42
X
43
LLX
46
EAX
49
X
50
LNX
53
AQRAPK
，
VDAEX5DX7X8LEX
11
ARX
14
X
15
IEX
18
‑
[Z]
‑
X
41
X
42
X
43
LLX
46
EAX
49
X
50
LNX
53
AQAPK
，或
VDAEX5DX7X8LEX
11
ARX
14
X
15
IEX
18
‑
[Z]
‑
X
41
X
42
X
43
LLX
46
EAX
49
X
50
LNX
53
ARAPK(
分别是
SEQ ID NO.52
‑
55)。3.
如权利要求1或2所述的亲和配体，其中
[Z]
包含葡萄球菌
A
蛋白
(SPA)Z
‑
结构域
、A
‑
结构域
、B
‑
结构域
、C
‑
结构域
、D
‑
结构域和
E
‑
结构域中的任一个，优选
Z
‑
结构域的
SPA
结构域的螺旋2，或其任何碱稳定变体
。4.
如权利要求1‑3中任一项所述的亲和配体，其中
[Z]
选自具有包含以下的氨基酸序列的肽中的任一种：
LPNLTEEQRRAFIESLRDD PPQ(SEQ ID NO.38)、LPNLTEERRRAFIESLRDDPSQ(SEQ ID NO.39)、LPNLTEEQRRAFIESLRDGPSQ(SEQ ID NO.40)、LPY LTEEQRRAFIESLRDDPSQ(SEQ ID NO.41)、LPNLTEEQRRIFIES LRDDPSQ(SEQ ID NO.42)、LPNLTEEQRRTFIESLRDDPSQ(SE Q ID NO.43)、LPNLTEEQRRAFIEPLRDDPSQ(SEQ ID NO.44)
或
LPNLTEEQRRA...

【专利技术属性】
技术研发人员：C，
申请(专利权)人：艾维泰有限责任公司，
类型：发明
国别省市：