AAV8亲和剂制造技术

本文提供了与AAV8衣壳和/或AAV8变体衣壳特异性相互作用的亲和配体、包含所述亲和配体的亲和剂，以及它们用于结合、分离和/或纯化AAV8及其变体的方法。AAV8及其变体的方法。AAV8及其变体的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】AAV8亲和剂
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2020年10月13日提交的美国临时申请号63/091,207的优先权权益，所述申请的整个内容以引用的方式并入本文。


[0003]本公开涉及色谱领域，并且更具体地涉及适用于分离腺相关病毒(AAV)的新型亲和配体和亲和剂。因此，本公开涵盖亲和配体本身、包含根据本公开的亲和配体的色谱分离基质(亲和剂)和AAV分离，特别是AAV血清型8(AAV8)分离的方法，其中使用根据本公开的配体。

技术介绍

[0004]生物产生的治疗剂的纯度受到当局的严格审查和监管，以确保安全性和有效性。因此，需要将生物产生的治疗剂有效纯化至高纯度。
[0005]为了支持先进治疗药物产品(ATMP)的临床努力，需要从重组来源有效纯化ATMP的组合物和方法。亲和纯化是一种通过几个步骤或单个步骤分离和/或获得所需蛋白质纯度的手段。然而，包含与固体支持物结合的亲和配体的分离基质的开发可能是资源密集型和耗时的任务，并且因此存在用于极少数蛋白质的亲和分离基质。在不存在亲和分离基质的情况下，纯化通常涉及低效过程，诸如多柱过程。
[0006]腺相关病毒(AAV)是细小病毒家族的成员，是一种小型无包膜病毒。AAV颗粒包含由60个衣壳蛋白亚基VP1、VP2和VP3构成的AAV衣壳，其中包含约4.7千碱基(kb)的单链DNA基因组。这些VP1、VP2和VP3蛋白以约1∶1∶10的预测比存在，并以二十面体对称排列。单个粒子仅包装一条DNA分子链，但这可能是正链或负链，两者都具有传染性。与大多数病毒不同，AAV天生无致病性、免疫原性差且具有广泛的嗜性。许多AAV血清型已被鉴定为具有可变嗜性。AAV的组织特异性由病毒衣壳血清型决定。这种特异性允许将感兴趣的基因靶向某些组织和细胞。非致病性、广泛的感染性宿主范围(包括非分裂细胞)和整合的特性使AAV血清型(诸如AAV8)成为一种有吸引力的媒介物。
[0007]重组腺相关病毒(rAAV)是研究最多的用于递送人类基因治疗的病毒载体之一。重组AAV缺少病毒整合和复制的两个必需基因。因此，rAAV主要保持附加型，并且可在非分裂细胞中持续很长时间。由于这些特征以及靶向特定组织类型的能力，重组AAV已成为用于研究和基因治疗应用的主要病毒载体之一。AAV血清型表现出各种细胞嗜性和与细胞受体的相互作用，以允许进入细胞并将遗传物质递送到细胞核中进行表达。rAAV的制造既困难又昂贵。细胞培养生产力低，并且通常只能达到每升10
13
‑
10
15
个病毒衣壳，相当于大约0.1
‑
10mg/L。纯化主要通过使用亲和色谱来完成。目前，只有四种亲和树脂可用于AAV的纯化，POROS
TM CaptureSelect
TM AAV9、POROS
TM CaptureSelect
TM AAVX、POROS
TM CaptureSelect
TM AAV8和AVB Sepharose。这些树脂有两大缺点，一是不能用氢氧化钠清洗，二是只能重复使用几个循环。这增加了树脂消耗并导致纯化应用的树脂成本高。因此，需要对AAV8和AAV8变
体具有高特异性的亲和剂，所述亲和剂是碱稳定的并且可支持AAV8和AAV8变体的产生和纯化。

技术实现思路

[0008]本文描述了结合AAV8并可用于分离和/或亲和纯化AAV8衣壳和/或AAV8变体衣壳的亲和配体和亲和剂。
[0009]在一个方面，本公开提供了与AAV8衣壳或AAV8的变体衣壳特异性结合的亲和配体，所述亲和配体包含由下式表示的氨基酸序列，从N末端到C末端，
[0010][A]‑
X1QRRX2FIX3X4LRX5DPX6X7SX8X9LLX
10 X
11
AX
12
X
13
X
14
X
15
X
16
X
17
‑
[B](SEQ ID NO：1)
[0011]其中
[0012](a)[A]包含第一α
‑
螺旋形成肽结构域；
[0013](b)X1是A、R、N、S、D、L、Q或I，优选R；
[0014](c)X2是G、H、P或S，优选S；
[0015](d)X3是A或Y，优选Y；
[0016](e)X4是R或S，优选R；
[0017](f)X5是E、H或Q，优选Q；
[0018](g)X6是E或S，优选S；
[0019](h)X7是F、V或Y，优选F；
[0020](i)X8是A、E或R，优选A；
[0021](j)X9是H、I或N，优选H；
[0022](k)X
10
是A、E或R，优选A；
[0023](1)X
11
是D或E，优选D；
[0024](m)X
12
是K或R，优选K；
[0025](n)X
13
是Q、T或Y，优选Y；
[0026](o)X
14
是D、L或R，优选R；
[0027](p)X
1s
是A或N，优选N；
[0028](q)X
16
是D、L或R，优选R；
[0029](r)X
17
是A、D、E、F、G、I、K、L、P、Q、R、S、T或Y，优选I；
[0030](s)[B]包含含有氨基酸序列QAPX
18
(SEQ ID NO：2)或QAPX
18
VD(SEQ ID NO：3)的肽，其中X
18
是A、K或R。
[0031]在某些实施方案中，[A]包含具有氨基酸序列VDAKFDKELEEARAEIERLPNLTE(SEQ ID NO：4)或VDAKFDKELEEIRAEIERLPNLTE(SEQ ID NO：5)的肽。在某些实施方案中，上式中[A]的N末端是蛋氨酸(M)或MAQGT(SEQ ID NO：6)。在某些实施方案中，上式的[B]具有氨基酸序列QAPKVD(SEQ ID NO：7)或QAPRVD(SEQ ID NO：8)。在其他实施方案中，[B]包含具有氨基酸序列QAPX
18
‑
[C](SEQ ID NO：9)的肽，X
18
是A、K或R，并且其中[C]是选自由以下组成的组的肽结构域：
[0032](a)VDGQAGQGGGSGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(SEQ ID NO：10)，
[0033](b)GQAGQGGGSGLNDIFESEQ ID NO：2AQKIEWHEHHHHHH(SEQ ID NO：11)，
[0034](c)VDGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(SE本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种亲和配体，其包含由下式表示的氨基酸序列，从N末端到C末端，[A]
‑
X1QRRX2FIX3X4LRX5DPX6X7SX8X9LLX
10 X
11
AX
12
X
13
X
14
X
15
X
16
X
17
‑
[B](SEQ ID NO：1)其中(a)[A]包含第一α
‑
螺旋形成肽结构域；(b)X1是A、R、N、S、D、L、Q或I，优选R；(c)X2是G、H、P或S，优选S；(d)X3是A或Y，优选Y；(e)X4是R或S，优选R；(f)X5是E、H或Q，优选Q；(g)X6是E或S，优选S；(h)X7是F、V或Y，优选F；(i)X8是A、E或R，优选A；(j)X9是H、I或N，优选H；(k)X
10
是A、E或R，优选A；(1)X
11
是D或E，优选D；(m)X
12
是K或R，优选K；(n)X
13
是Q、T或Y，优选Y；(o)X
14
是D、L或R，优选R；(p)X
15
是A或N，优选N；(q)X
16
是D、L或R，优选R；(r)X
17
是A、D、E、F、G、I、K、L、P、Q、R、S、T或Y，优选I；(s)[B]包含含有氨基酸序列QAPX
18
(SEQ ID NO：2)或QAPX
18
VD(SEQ ID NO：3)的肽，其中X
18
是A、K或R；并且其中所述亲和配体特异性地与腺相关病毒亚型8(AAV8)颗粒或衣壳或AAV8的变体颗粒或衣壳相互作用。2.如权利要求1所述的亲和剂，其中[A]包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：4的肽。3.如权利要求1所述的亲和剂，其中[A]包含具有氨基酸序列SEQ ID NO：5的肽。4.如权利要求1或2所述的亲和配体，其中[A]的N末端是M或MAQGT(SEQ ID NO：6)。5.如权利要求1
‑
4中任一项所述的亲和配体，其中[B]具有氨基酸序列QAPKVD(SEQ ID NO：7)或QAPRVD(SEQ ID NO：8)。6.如权利要求1
‑
4中任一项所述的亲和配体，其中[B]包含具有氨基酸序列QAPX
18
‑
[C](SEQ ID NO：9)的肽，其中[C]是选自由以下组成的组的肽结构域：(a)VDGQAGQGGGSGLNDIFEAQKIEWHEHHHHHH(SEQ ID NO：10)，(b)GQAGQGGGSGLNDIFEAQKIEWH...

【专利技术属性】
技术研发人员：S，
申请(专利权)人：艾维泰有限责任公司，
类型：发明
国别省市：