本申请涉及检测样品中游离B细胞刺激因子的方法，所述方法包括以下步骤：a. 使用亲和捕获介质过滤样品；b. 在预包被捕获抗体的酶标板中加入经步骤a过滤的样品并孵育；c. 用洗板液冲洗，加入检测抗体并孵育；d. 用洗板液冲洗，加入底物工作液并孵育；e. 加入终止液，使用酶标仪读取吸光度；其中所述亲和捕获介质选自：Protein A琼脂糖凝胶、Protein G琼脂糖凝胶和Protein L琼脂糖凝胶。L琼脂糖凝胶。
【技术实现步骤摘要】
检测游离B细胞刺激因子的方法
[0001]本申请涉及检测游离B细胞刺激因子的方法及其应用。
技术介绍
[0002]B细胞刺激因子（B lymphocyte stimulator, BLyS）主要表达于髓系细胞表面，其为同源三聚化的II型穿膜蛋白，属于肿瘤坏死因子家族；通常胞外区部分在蛋白酶作用下发生水解，形成可溶性BLyS。
[0003]新药研发过程中，机体和药物的相互作用，需要了解药物和疗效、药物与靶标的结合率以及毒性之前的关系。建立监测游离BLyS浓度随靶向BLyS新药给药后的变化情况，为建立药效模型奠定数据基础至关重要。
[0004]通过调研现有的检测BLyS的方法，目前无任何一个方法可以检测机体在给予针对不同的靶向BLyS新药后，体内游离BLyS浓度的变化趋势。建立一个通用的检测游离BLyS方法可以加速新药上市进程，同时也能为新药研究过程中，找到无创性生物标志物即药效指标提供依据。
[0005]目前本领域的难点在于如何能检测到游离的Blys。
技术实现思路
[0006]第一方面，本申请提供了亲和捕获介质在制备用于检测样品中游离B细胞刺激因子的方法的试剂盒中的用途，所述方法包括以下步骤：a. 使用亲和捕获介质过滤样品；b. 在预包被捕获抗体的酶标板中加入经步骤a过滤的样品并孵育；c. 用洗板液冲洗，加入检测抗体并孵育；d. 用洗板液冲洗，加入底物工作液并孵育；e. 加入终止液，使用酶标仪读取吸光度；其中所述亲和捕获介质选自：Protein A琼脂糖凝胶、Protein G琼脂糖凝胶和Protein L琼脂糖凝胶。
[0007]在一个实施方式中，在步骤a之前，所述方法还包括预处理亲和捕获介质的步骤：在离心速度为2500rpm且离心时间为5分钟的条件下，使用磷酸缓冲液冲洗亲和捕获介质。
[0008]在一个实施方式中，步骤a的过滤包括，将样品加入亲和捕获介质中并室温过夜静置孵育，再离心收集过滤的样品。
[0009]在一个实施方式中，步骤b还包括，在加入经步骤a过滤的样品之后，加入Assay Diluent RD1
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111以封板。
[0010]在一个实施方式中，步骤b的孵育为在室温下以500
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600 rpm振荡孵育3小时。
[0011]在一个实施方式中，步骤c的孵育为在室温下以500
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600 rpm振荡孵育1小时。
[0012]在一个实施方式中，步骤d的孵育为在室温下以500
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600 rpm振荡孵育30分钟。
[0013]在一个实施方式中，所述亲和捕获介质是Protein A配体偶联于4%琼脂糖凝胶的孔径为1 μm的微孔板。
[0014]第二方面，本申请提供了检测样品中游离B细胞刺激因子的方法，所述方法包括以下步骤：a. 使用亲和捕获介质过滤样品；b. 在预包被捕获抗体的酶标板中加入经步骤a过
滤的样品并孵育；c. 用洗板液冲洗，加入检测抗体并孵育；d. 用洗板液冲洗，加入底物工作液并孵育；e. 加入终止液，使用酶标仪读取吸光度；其中所述亲和捕获介质选自：Protein A琼脂糖凝胶、Protein G琼脂糖凝胶和Protein L琼脂糖凝胶。
[0015]在一个实施方式中，在步骤a之前，所述方法还包括预处理亲和捕获介质的步骤：在离心速度为2500rpm且离心时间为5分钟的条件下，使用磷酸缓冲液冲洗亲和捕获介质。
[0016]在一个实施方式中，步骤a的过滤包括，将样品加入亲和捕获介质中并室温过夜静置孵育，再离心收集过滤的样品。
[0017]在一个实施方式中，步骤b还包括，在加入经步骤a过滤的样品之后，加入Assay Diluent RD1
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111以封板。
[0018]在一个实施方式中，步骤b的孵育为在室温下以500
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600 rpm振荡孵育3小时。
[0019]在一个实施方式中，步骤c的孵育为在室温下以500
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600 rpm振荡孵育1小时。
[0020]在一个实施方式中，步骤d的孵育为在室温下以500
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600 rpm振荡孵育30分钟。
[0021]在一个实施方式中，所述亲和捕获介质是Protein A配体偶联于4%琼脂糖凝胶的孔径为1 μm的微孔板。
[0022]第三方面，本申请提供了用于检测样品中游离B细胞刺激因子的试剂盒，所述试剂盒包括第二方面所述的方法中的试剂。
具体实施方式
[0023]第一方面，本申请提供了亲和捕获介质在制备用于检测样品中游离B细胞刺激因子的方法的试剂盒中的用途，所述方法包括以下步骤：a. 使用亲和捕获介质过滤样品；b. 在预包被捕获抗体的酶标板中加入经步骤a过滤的样品并孵育；c. 用洗板液冲洗，加入检测抗体并孵育；d. 用洗板液冲洗，加入底物工作液并孵育；e. 加入终止液，使用酶标仪读取吸光度；其中所述亲和捕获介质选自：Protein A琼脂糖凝胶、Protein G琼脂糖凝胶和Protein L琼脂糖凝胶。在一个实施方式中，使用酶标仪读取吸光度时，检测波长为450 nm，参比波长为570 nm。
[0024]在一个实施方式中，所述检测抗体是人BAFF/BLyS缀合物。
[0025]在一个实施方式中，所述检测抗体是辣根过氧化物酶标记的抗人Blys多克隆抗体。
[0026]在一个实施方式中，所述洗板液是0.05% tween 20的磷酸盐缓冲液。
[0027]在一个实施方式中，所述捕获抗体是包被对人BAFF/BLyS特异化的单克隆抗体。
[0028]在一个实施方式中，所述底物工作液是TMB（Tetramethylbenzidine）。
[0029]在一个实施方式中，所述终止液是2N硫酸。
[0030]在一个实施方式中，在步骤a之前，所述方法还包括预处理亲和捕获介质的步骤：在离心速度为2500 rpm且离心时间为5分钟的条件下，使用磷酸缓冲液冲洗亲和捕获介质。
[0031]在一个实施方式中，所述磷酸缓冲液是1
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PBS缓冲液。
[0032]在一个实施方式中，步骤a的过滤包括，将样品加入亲和捕获介质中并室温过夜静置孵育，再离心收集过滤的样品。
[0033]在一个实施方式中，所述离心是2500 rpm离心15分钟。
[0034]在一个实施方式中，样品按200μL/孔加入亲和捕获介质中。
[0035]在一个实施方式中，在步骤b中，以50 μL/孔加入经步骤a过滤的样品。
[0036]在一个实施方式中，步骤b还包括，在加入经步骤a过滤的样品之后，加入Assay Diluent RD1
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111以封板。
[0037]Assay Diluent RD1
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111为含防腐剂的蛋白溶液。
[0038]在一个实施方式中，在步骤b中本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.亲和捕获介质在制备用于检测样品中游离B细胞刺激因子的方法的试剂盒中的用途，所述方法包括以下步骤：a. 使用亲和捕获介质过滤样品；b. 在预包被捕获抗体的酶标板中加入经步骤a过滤的样品并孵育；c. 用洗板液冲洗，加入检测抗体并孵育；d. 用洗板液冲洗，加入底物工作液并孵育；e. 加入终止液，使用酶标仪读取吸光度；其中所述亲和捕获介质选自：Protein A琼脂糖凝胶、Protein G琼脂糖凝胶和Protein L琼脂糖凝胶。2.如权利要求1所述的用途，其中在步骤a之前，所述方法还包括预处理亲和捕获介质的步骤：在离心速度为2500rpm且离心时间为5分钟的条件下，使用磷酸缓冲液冲洗亲和捕获介质。3.如权利要求1所述的用途，其中步骤a的过滤包括，将样品加入亲和捕获介质中并室温过夜静置孵育，再离心收集过滤的样品。4.如权利要求1所述的用途，其中步骤b还包括，在加入经步骤a过滤的样品之后，加入Assay Diluent RD1
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111以封板。5. 如权利要求1所述的用途，其中，步骤b的孵育为在室温下以500
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600 rpm振荡孵育3小时；和/或步骤c的孵育为在室温下以500
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600 rpm振荡孵育1小时；和/或步骤d的孵育为在室温下以500
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600 rpm振荡孵育30分钟。6. 如权利要求1所述的用途，其中所述亲和捕获介质是Protein A配体偶联于4%琼脂糖凝胶的孔径为1 μm的微孔板。7.检测样品中游离B细胞刺激因子的方法，所述方法包...
【专利技术属性】
技术研发人员：王变珍，王敏瑞，王琪，武丽华，
申请(专利权)人：军科正源北京药物研究有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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