一种同时检测门冬胰岛素和德谷胰岛素的方法及其血浆样品处理方法技术

本申请涉及一种同时检测门冬胰岛素和德谷胰岛素的方法及其血浆样品处理方法。本申请通过优化不同液质联用仪、液质条件、色谱柱以及前处理的方法，建立了一种高灵敏度、高特异性、高通量且稳定可靠的液相色谱串联质谱(LC

【技术实现步骤摘要】
一种同时检测门冬胰岛素和德谷胰岛素的方法及其血浆样品处理方法


[0001]本申请涉及检测领域，具体而言，涉及一种同时检测门冬胰岛素和德谷胰岛素的方法及其血浆样品处理方法。

技术介绍

[0002]德谷门冬双胰岛素注射液是首个由超长效胰岛素和速效胰岛素组合而成的双胰岛素制剂，与基础胰岛素类似物比较，德谷门冬双胰岛素能兼顾空腹和餐后血糖控制。鉴于这种优势，这种双胰岛素的研发和生产工艺的改进优化也成了热点。
[0003]文献报道的胰岛素常用的检测方法是免疫法和液质联用法，免疫法虽然灵敏度较高，但是免疫法耗时，容易受内源性类似物及其代谢物的干扰并且试剂昂贵；因此采用液质联用平台定量检测基质样品中胰岛素浓度受到了工业届的青睐，该平台具有特异性好，方法准确性高，可区分待测物和干扰物等优点。采用液质平台检测胰岛素的文献，基本都是只检测德谷胰岛素或者门冬胰岛素的单一胰岛素定量的报道。由于胰岛素检测需要较高的灵敏度，同时也容易受内源性物质的干扰，因此目前报道的质谱检测方法也存在不足。尤其是两个胰岛素同时检测更是增加了难度，既要同时兼顾两个胰岛素的灵敏度，同时也需要两个胰岛素的色谱峰没有干扰且峰形对称。而实际中往往是照顾了德谷胰岛素的色谱峰形和灵敏度，门冬胰岛素的峰形交叉同时灵敏度也不达标；同理，满足了门冬胰岛素的检测需求，那么德谷胰岛素又无法兼顾峰形和灵敏度。
[0004]因此迫切需要高灵敏、高特异性和高通量的分析方法来同时检测门冬胰岛素和德谷胰岛素两种胰岛素。

技术实现思路

[0005]本申请通过优化不同液质联用仪、液质条件、色谱柱以及前处理的方法，建立了一种高灵敏度、高特异性、高通量且稳定可靠的液相色谱串联质谱(LC
‑
MS/MS)法，定量检测血基质中德谷胰岛素和门冬胰岛素的浓度。
[0006]为了同时有效地检测两种胰岛素，本申请提供了如下实施方案：在第一方面，本申请提供了一种用于同时检测门冬胰岛素和德谷胰岛素的血浆样品预处理方法，其包括：a)在含有门冬胰岛素和德谷胰岛素的血浆样品中加入牛胰岛素内标工作液；b)在步骤a)的血浆样品中加入沉淀剂溶液进行沉淀，并取上清液；c)对步骤b)获得的上清液进行固相萃取，以获得用于检测的血浆样品。
[0007]在第二方面，本申请提供了一种用于同时检测门冬胰岛素和德谷胰岛素的方法，其包括：a)提供通过第一方面所述的方法获得的血浆样品；b)通过LC
‑
MS/MS分析测量所述血浆样品中门冬胰岛素和德谷胰岛素的浓度。
[0008]本申请建立了一种准确可靠的同时检测血基质中德谷胰岛素和门冬胰岛素的方法。优势包括以下的一项或多项：1、方法特异性好，能够解决血基质中的干扰问题；2、实现了同时检测德谷胰岛素和门冬胰岛素，大大提高了检测效率；3、灵敏度高，满足临床项目检测要求。
附图说明
[0009]图1显示了门冬胰岛素与干扰物的色谱图;图2显示了不同仪器作出的门冬胰岛素与干扰物的色谱图;图3显示了门冬胰岛素的峰形以及与干扰物分离的色谱图;图4显示了德谷胰岛素的峰形以及与干扰物分离的色谱图;图5显示了利用本申请的方法检测的门冬胰岛素的色谱图;图6显示了利用本申请的方法检测的德谷胰岛素的色谱图;图7显示了利用不同色谱柱检测的门冬胰岛素的色谱图;图8显示了利用不同色谱柱检测的德谷胰岛素的色谱图;图9显示了门冬胰岛素的标准曲线;图10显示了德谷胰岛素的标准曲线。
具体实施方式
[0010]由于胰岛素检测需要较高的灵敏度，同时也容易受内源性物质的干扰，因此目前报道的质谱检测方法也存在不足。尤其是两个胰岛素同时检测更是增加了难度，既要同时兼顾两个胰岛素的灵敏度，同时也需要两个胰岛素的色谱峰没有干扰且峰形对称。而实际中往往是照顾了德谷胰岛素的色谱峰形和灵敏度，门冬胰岛素的峰形交叉同时灵敏度也不达标；同理，满足了门冬胰岛素的检测需求，那么德谷胰岛素又无法兼顾峰形和灵敏度。
[0011]图1和图2显示了通过(Waters, Xevo TQ
‑
S和AB SCIEX TRIPLE QUAD 6500+)检测的内源性物质干扰图。图1显示了门冬胰岛素有干扰，但是容易分开，然而图2显示了门冬胰岛素与干扰物分离度较差，需优化方法分开。
[0012]图3和图4显示了通过(Waters，Xevo TQ
‑
S)检测的两种胰岛素的峰形。除了需要分离干扰物，德谷胰岛素和门冬胰岛素的峰形也需要对称且稳定。如图3所示，门冬胰岛素与干扰物分开且峰形较好，但是德谷胰岛素与干扰物虽然分开，但是分离度不是很好，影响德谷胰岛素的准确积分，如图4所示。
[0013]为了同时有效地检测两种胰岛素，本申请提供了如下实施方案：在第一方面，本申请提供了一种用于同时检测门冬胰岛素和德谷胰岛素的血浆样品预处理方法，其包括：a)在含有门冬胰岛素和德谷胰岛素的血浆样品中加入牛胰岛素内标工作液；b)在步骤a)的血浆样品中加入沉淀剂溶液进行沉淀，并取上清液；c)对步骤b)获得的上清液进行固相萃取，以获得用于检测的血浆样品。
[0014]在一些具体的实施方案中，所述沉淀剂为体积比为约300:100:4的甲醇：超纯水：浓氨水。
[0015]在一些具体的实施方案中，所述固相萃取利用固相萃取(SPE)板进行。
[0016]在一些具体的实施方案中，所述固相萃取板为Oasis
®
MAX μElution Plate 30 μm固相萃取板。
[0017]在一些具体的实施方案中，所述固相萃取采用淋洗液除去多余物质，并且采用洗脱液将门冬胰岛素和德谷胰岛素同时洗脱下来。
[0018]在一些具体的实施方案中，所述淋洗液为体积比为约5:100的浓氨水：超纯水和/或体积比为约150:1000:1的甲醇：超纯水：乙酸。
[0019]在一些具体的实施方案中，所述洗脱液为体积比为约8:2:1的甲醇：超纯水：乙酸。
[0020]在第二方面，本申请提供了一种用于同时检测门冬胰岛素和德谷胰岛素的方法，其包括：a)提供通过第一方面所述的方法获得的血浆样品；b)通过LC
‑
MS/MS分析测量所述血浆样品中门冬胰岛素和德谷胰岛素的浓度。
[0021]在一些具体的实施方案中，所述LC
‑
MS/MS分析采用ACE 3 C18
‑
300，100
×
2.1mm 色谱柱。
[0022]在一些具体的实施方案中，所述LC
‑
MS/MS分析采用质谱离子对971.87
ꢀ→
1146.20和1221.11
→
641.51。
[0023]在一些具体的实施方案中，所述LC
‑
MS/MS分析采用的电压为约18eV和34eV。
[0024]在一些具体的实施方案中，在所述LC
‑
MS/MS分析中，有机相的运行时间为为约9min，并且流动相中有机相的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于同时检测门冬胰岛素和德谷胰岛素的血浆样品预处理方法，其包括：a)在含有门冬胰岛素和德谷胰岛素的血浆样品中加入牛胰岛素内标工作液；b)在步骤a)的血浆样品中加入沉淀剂溶液进行沉淀，并取上清液；以及c)对步骤b)获得的上清液进行固相萃取，以获得用于检测的血浆样品。2.如权利要求1所述的方法，其中所述固相萃取利用固相萃取(SPE ) 板进行，优选地，所述固相萃取板为Oasis
®
MAX μElution Plate 30 μm固相萃取板。3.如权利要求1或2所述的方法，其中所述固相萃取采用淋洗液除去多余物质，并且采用洗脱液将门冬胰岛素和德谷胰岛素同时洗脱下来。4.如权利要求3所述的方法，其中所述淋洗液为体积比为约5:100的浓氨水：超纯水和/或体积比为约150:1000:1的甲醇：超纯水：乙酸，任选地，所述洗脱液为体积比为约8:2:1的甲醇：超纯水：乙酸。5.如权利要求1或2所述的方法，其中所述血浆样品是冷冻保藏的，并且所述血浆样品被反复冻融不超过4次，任选地，所述血浆样品在室温下不要放置超过18小时。6.如权利要求1或2所述的方法，其中所...

【专利技术属性】
技术研发人员：张怀敬，王珊珊，武文霞，
申请(专利权)人：军科正源北京药物研究有限责任公司，
类型：发明
国别省市：