一种提高唾液酸乳糖产量的基因工程菌及其生产方法技术

本发明专利技术公开了一种提高唾液酸乳糖产量的基因工程菌及其生产方法，属于生物技术和食品发酵工程领域。本发明专利技术通过对基因neuB，neuC，neuA，lacY，lst和/或pst6

【技术实现步骤摘要】
一种提高唾液酸乳糖产量的基因工程菌及其生产方法


[0001]本专利技术涉及一种提高唾液酸乳糖产量的基因工程菌及其生产方法，属于生物技术和食品发酵工程领域。

技术介绍

[0002]人乳寡糖(human milk oligosaccharides，HMOs)具有调节肠道微生物活性、提高免疫反应和预防坏死性小肠结肠炎等功效，是母乳中仅次于乳糖和脂质的第三大固体营养成分，对婴幼儿消化系统的稳态和发育，以及出生后免疫系统的完善和建立发挥着重要作用。在婴幼儿配方乳粉中的添加HMOs可以缩小母乳与配方乳粉之间的营养差距。唾液酸乳糖(3(6)'
‑
sialyllactose，3(6)'
‑
SL)是HMOs中的一种重要成分，通过α
‑
2,3(6)唾液酸转移酶对CMP
‑
唾液酸进行转乳糖基化反应而形成的，体外研究表明：HMOs中的3'
‑
SL和6'
‑
SL通过调节肠—脑轴支持正常的微生物群落和应激期间的行为反应。因此采用母乳喂养的婴儿，其大脑发育更加完善、神经突触更加丰富、神经系统也更加发达。鉴于唾液酸乳糖的重要生物功效，为进一步阐明其作用机制，需要制备大量结构均一的该类化合物，然而从天然产物中分离提取所得到的量很少，远不及研究的需要，因此通过人工合成的方法获得该类化合物成为最佳选择。
[0003]唾液酸乳糖的合成方法主要包括三种：分别是化学合成、酶法合成和生物发酵合成。唾液酸乳糖的化学合成需要众多繁琐的保护和脱保护步骤。酶促合成由于供体底物核苷酸糖相对昂贵且产量低，使得合成的唾液酸乳糖成本较高，不适于工业化应用。利用改造的工程菌株进行生物合成唾液酸乳糖，可以从廉价碳源(葡萄糖、甘油、乳糖)生产唾液酸乳糖，日益受到广泛关注。
[0004]目前关于生物发酵制备唾液酸乳糖，以2008年Eric Samain等通过敲除nanT、nanA、nanK、nanE，过表达neuB、neuA、neuC以及α
‑
2,3唾液酸转移酶，生成25.5g/L的3'
‑
SL；2010年该课题组以同样方法构建6'
‑
SL路径，仅将3'
‑
SL从头合成路径中的α
‑
2,3唾液酸转移酶更改为α
‑
2,6唾液酸转移酶，发酵获得34g/L的6'
‑
SL为最高产量。目前报道的微生物生产的方法及唾液酸乳糖的产量仍不能满足工业化生产的需求。因此，寻求廉价高产的唾液酸乳糖从头合成途径来解决目前微生物生产的瓶颈，打造更高效的生产菌株是目前急需解决的问题。

技术实现思路

[0005][技术问题][0006]现有技术生产唾液酸乳糖的成本相对高昂，且产量较低，不足以实现工业化生产，无法提供高效生产唾液酸乳糖的菌株，也不能提供成本低廉且绿色高效生产唾液酸乳糖的方法。
[0007][技术方案][0008]本专利技术为了解决现有生物法合成的唾液酸乳糖产量较低的问题，提供了一种产唾
液酸乳糖的基因工程菌及其构建方法。
[0009]本专利技术的第一个目的是提供一种生产唾液酸乳糖基因工程菌，所述基因工程菌敲除β
‑
半乳糖苷酶编码基因lacZ，并异源表达编码乙酰神经氨酸合成酶的neuB基因、编码N
‑
乙酰葡萄糖胺异构酶的neuC基因、编码CMP
‑
唾液酸合成酶的neuA基因、乳糖转移酶编码基因lacY、谷氨酰胺合成酶编码基因glnA和UDP
‑
乙酰葡糖胺合成途径；过表达编码α
‑
2,3唾液酸转移酶基因或编码α
‑
2,6唾液酸转移酶基因。
[0010]在一种实施方式中，所述UDP
‑
乙酰葡糖胺合成途径为葡萄糖胺
‑6‑
磷酸合成酶编码基因glmS、葡萄糖胺合成酶编码基因glmM和/或UDP
‑
乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶编码基因glmU。
[0011]在一种实施方式中，所述基因工程菌还敲除唾液酸醛缩酶编码基因nanA、6
‑
磷酸果糖激酶编码基因pfkA和/或葡萄糖胺
‑
6磷酸脱氨酶编码基因nagB。
[0012]在一种实施方式中，所述乙酰神经氨酸合成酶基因neuB、N
‑
乙酰葡萄糖胺异构酶基因neuC、CMP
‑
唾液酸合成酶基因neuA均来源于空肠弯曲杆菌Campylobacterjejuni。
[0013]在一种实施方式中，所述乙酰神经氨酸合成酶基因neuB、N
‑
乙酰葡萄糖胺异构酶基因neuC、CMP
‑
唾液酸合成酶基因neuA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.3所示。
[0014]在一种实施方式中，乳糖转移酶基因lacY、葡萄糖胺
‑6‑
磷酸合成酶基因glmS、葡萄糖胺合成酶基因glmM、UDP
‑
乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶基因glmU和谷氨酰胺合成酶基因glnA均来源于大肠杆菌K
‑
12，其核苷酸序列如SEQ ID NO.6～SEQ ID NO.10所示。
[0015]在一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主。
[0016]在一种实施方式中，所述大肠杆菌包括MG1655、DH5α、BL21(DE3)、JM109或HB101。
[0017]在一种实施方式中，所述大肠杆菌为大肠杆菌BL21。
[0018]在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pETDuet
‑
1、pRSFDuet
‑
1、pCDFDuet
‑
1、pACYCDuet
‑
1或pCOLADuet
‑
1质粒表达基因neuB、neuC、neuA、lacY、glmM、glmS、glmU、glnA、唾液酸转移酶编码基因。
[0019]在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pETDuet
‑
1质粒表达基因neuB、neuC、neuA，利用pRSFDuet
‑
1质粒表达基因lacY、唾液酸转移酶编码基因。
[0020]在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pETDuet
‑
1质粒表达基因neuB、neuC、neuA，利用pCDFDuet
‑
1质粒表达基因lacY、唾液酸转移酶编码基因。
[0021]在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pETDuet
‑
1质粒表达基因neuB、neuC、neuA，利用pACYCDuet
‑
1质粒表达基因lacY、唾液酸转移酶编码基因。
[0022]在一种实施方式中，所述基因工程菌利用pETDuet
‑
1质粒表达基因neuB、neuC、n本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产唾液酸乳糖的基因工程菌，其特征在于，敲除β
‑
半乳糖苷酶编码基因lacZ，并异源表达编码乙酰神经氨酸合成酶的neuB基因、编码N
‑
乙酰葡萄糖胺异构酶的neuC基因、编码CMP
‑
唾液酸合成酶的neuA基因、乳糖转移酶编码基因lacY、谷氨酰胺合成酶编码基因glnA和UDP
‑
乙酰葡糖胺合成途径；过表达编码唾液酸转移酶基因；所述UDP
‑
乙酰葡糖胺合成途径为葡萄糖胺
‑6‑
磷酸合成酶编码基因glmS、葡萄糖胺合成酶编码基因glmM和/或UDP
‑
乙酰葡萄糖胺焦磷酸化酶编码基因glmU。2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌还敲除唾液酸醛缩酶编码基因nanA、6
‑
磷酸果糖激酶编码基因pfkA和/或葡萄糖胺
‑
6磷酸脱氨酶编码基因nagB。3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述唾液酸转移酶基因为α
‑
2,3唾液酸转移酶基因或α
‑
2,6唾液酸转移酶基因；所述编码α
‑
2,3唾液酸转移酶基因选自来源于脑膜炎奈瑟球菌Neisseriameningitidis的基因lst、来源于多杀性巴氏杆菌Pasteurellamultocida的基因Pm0188、突变体基因Pm0188*、来源于海藻百伯坦菌Bibersteiniatrehalosi的基因WQG、来源于淋病奈瑟菌Neisseriagonorrhoeae的基因Nst或突变体基因Nst*；所述编码α
‑
2,6唾液酸转移酶基因选自来源于光杆菌Photobacteriumsp.的基因pst6
‑
224、来源于鳆发光杆菌Photobacteriumleiognathi的基因plst6、突变体基因plst6*来源于美人鱼发光杆菌Photobacterium damselae的基因bst或突变体基因bst*。4.根据权利要求1～3任一所述的基因工程菌，其特征在于，利用pETDuet
‑
1、pRSFDuet
‑
1、pCDFDuet
‑
...

【专利技术属性】
技术研发人员：张涛，李晨晨，李梦丽，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：