一种猪霍乱沙门菌、外膜囊泡、包含该外膜囊泡的纳米疫苗及其构建方法和应用技术

本发明专利技术属于纳米药物技术领域，具体涉及一种猪霍乱沙门菌、外膜囊泡、包含该外膜囊泡的纳米疫苗及其制备方法和应用，本发明专利技术的猪霍乱沙门菌，同时缺失pagL、pagP、lpxR基因，且在pagP突变位点插入有来源于弗朗西斯菌的脱磷酸酶基因lpxE；具有免疫效果好，又能降低内毒素毒性的特点。本发明专利技术的纳米疫苗包括外膜囊泡及外膜囊泡携带的谷氨酸脱氢酶蛋白，能够诱导产生较高水平抗体，具有制备用于猪霍乱沙门菌病和猪链球菌病(或其它猪的疾病)的主动免疫药物的前景。药物的前景。药物的前景。

【技术实现步骤摘要】
一种猪霍乱沙门菌、外膜囊泡、包含该外膜囊泡的纳米疫苗及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于纳米药物
，具体涉及一种猪霍乱沙门菌、外膜囊泡、包含该外膜囊泡的纳米疫苗及其制备方法和应用。

技术介绍

[0002]近年来，基于纳米颗粒的纳米疫苗受到广泛关注。纳米疫苗研究分为两个类别，一类是以合成纳米材料作为递送载体，比如脂质体(liposome)、金纳米颗粒(gold nanoparticles)、多聚纳米颗粒(polymeric nanoparticles)等；另一类是天然纳米颗粒，比如类病毒颗粒(virus
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like particles，VLP)、菌影(bacterial ghost)、外膜囊泡(outer membrane vesicles，OMVs)。外膜囊泡因其具有的独特优势而受到研究者的青睐，主要有：(1)OMVs的表面，保留了脂多糖、外膜蛋白、肽聚糖等具有佐剂特性的物质，它们能作为PAMPs被宿主识别，也能诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，增强免疫效果；(2)OMVs大小合适，可直接进入淋巴系统，易于被抗原递呈细胞递呈；(3)OMVs球状结构可以递送异源抗原，抗原可以被包裹在囊泡内，也可以嵌在膜外；(4)它不能自我复制，保证了安全性；(5)其脂质双分子层膜结构使其非常稳定，不会被机体过快清除。
[0003]外膜囊泡(outer membrane vesicles，OMVs)是革兰氏阴性菌及部分革兰氏阳性菌分泌的一种“纳米级”(20
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200nm)脂质双层球体。1965年，有研究首先在赖氨酸缺陷型培养基下生长的大肠杆菌的无细胞上清液中观察到可溶性脂多糖。后来Knox及其同事通过电子显微镜发现这些分泌的物质是膜结构的一部分，并得出这些囊泡来自外膜(OM)的结论。不断有研究表明，在正常的生长培养基下也会产生OMVs，不受赖氨酸缺乏的影响。之后大量的研究报道了从其他革兰氏阴性菌中观察或分离到OMVs的情况，如韦荣球菌、霍乱弧菌、肠炎沙门氏菌。OMVs能够容纳多种生物活性物质，如脂质、遗传物质、蛋白质等，在细菌致病性、细胞间交流等方面具有重要意义。
[0004]研究表明，已有多种蛋白质或蛋白质复合物，能够影响OMVs的形成。例如，当大肠杆菌缺失外膜蛋白Nlp1时会增加OMVs的产生，因为脂蛋白与肽聚糖的共价连接遭受了破坏。此外，Tol
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Pal蛋白复合物也能调节OMVs的生物生成，它由TolA、TolB、TolR和Pal组成，能横跨细菌内、外膜，当tolA基因缺失时可以大量增加大肠杆菌OMVs产量。还有许多细菌在缺失ompA后OMVs产量也会增加。
[0005]OMVs作为纳米囊泡，能够递送抗原甚至核酸等生物活性物质进入宿主。一方面，表达在OMVs表面的抗原分子可以被宿主细胞识别；另一方面，OMVs也可以进入宿主细胞并将表面相关的或囊泡内的内容物递送给宿主细胞。例如，肠毒性大肠杆菌通过OMVs分泌肠毒素，淋病奈瑟菌和鲍曼不动杆菌通过OMVs将其毒力因子PorB和OmpA靶向宿主细胞的线粒体，扰乱宿主细胞的平衡状态。此外，与OMVs膜相关的LPS可以被输送到巨噬细胞的细胞膜中，诱发炎症和热解细胞死亡(高度炎症性的细胞死亡，通常在病原体感染时诱发)。
[0006]微生物以分泌OMVs的方式来释放抗原、毒素，从而调控宿主与病原体的相互作用，
进而逃避宿主的免疫防御，由此达到自身免受抗生素或抗菌剂迫害的目的。另外，细菌的OMVs与宿主细胞相互作用后，可以对宿主细胞造成一定影响。如OMVs入侵宿主细胞后，会绕过细胞屏障，暴露在包括树突状细胞和中性粒细胞在内的免疫细胞面前，激活免疫细胞，消除OMVs引起的炎症反应。最后，尽管OMVs能包裹多种生物活性物质具有较好的免疫原性，但其含有的毒素或毒力因子会诱导宿主细胞凋亡。研究发现与益生菌OMVs相比，肠出血性大肠杆菌OMVs将引起肠上皮细胞的DNA损伤，这表明OMVs会导致细胞损伤和凋亡。
[0007]自2013年B型脑膜炎奈瑟菌OMVs疫苗在欧洲上市并取得良好效果之后，研究人员就未停止对致病菌外膜囊泡纳米疫苗的探索。外膜囊泡具有良好的免疫原性和佐剂活性，能有效刺激宿主免疫系统，因而具备开发成新型疫苗的潜力。此外，OMVs在高温和若干化学试剂处理后仍具有高稳定性，进一步表明其作为候选疫苗的优势。
[0008](1)天然分泌的OMVs疫苗
[0009]迄今为止，B型脑膜炎奈瑟菌的外膜囊泡疫苗是最具代表性的OMVs疫苗。除此之外，针对鼠伤寒沙门菌、霍乱弧菌、福氏志贺氏菌的OMVs疫苗研发已经开展相应的动物实验，但还没有开展临床试验。OMVs含有脂多糖、外膜蛋白和肽聚糖等具有佐剂特性的物质，可以作为PAMPs被宿主识别，经抗原递呈细胞(Antigen
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presenting cells，APCs)吞噬和处理，然后APCs将多肽
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MHC复合物递呈给CD4+或CD8+T细胞，诱导机体产生体液免疫或细胞免疫。OMVs的主要成分LPS是免疫细胞的有效刺激物，能特异性识别TLR4/MD2受体并触发NF
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κB和IRF 3依赖的基因表达。然而LPS因其含有内毒素成分类脂A，能在宿主机体内引起强烈的炎症反应，因此在投入使用前需解决天然分泌OMVs疫苗的安全性问题。
[0010](2)基于生物工程的OMVs疫苗
[0011]目前在实验室条件下OMVs递呈异源重组蛋白已经显示出巨大的潜力，许多学者选择将大肠杆菌溶血素蛋白(ClyA)与异源性蛋白抗原融合表达于OMVs。比如，有研究将ClyA与绿色荧光蛋白(GFP)、甲型流感基质蛋白2(M2)融合，免疫后能诱导机体产生针对GFP和M2的免疫反应。还有研究发现，与将抗原包裹在囊泡内相比，在OMVs表面呈递异源抗原能够诱导更强的免疫反应。再如，基于血红蛋白酶(Hemoglobin protease，Hbp)能够将异源抗原递呈到OMVs表面，荷兰学者开发出一种自动转运平台，成功用大肠杆菌OMVs递呈结核分枝杆菌抗原，用鼠伤寒沙门菌OMVs递呈肺炎链球菌PspA和Ply蛋白抗原，并能产生特异性免疫应答。另外，也有研究将猪链球菌几种蛋白抗原与OmpA信号肽融合，测定在大肠杆菌中表达纯化的OMVs免疫原性和免疫保护活性，结果显示OMVs诱发机体产生针对重组蛋白的高滴度抗体。
[0012](3)毒素降低的OMVs疫苗
[0013]在将OMVs作为疫苗应用的同时，应充分考虑如何降低其致炎性。一般可通过两方面来实现：其一是使用洗涤剂来处理OMVs，如目前市场上基于脑膜炎奈瑟菌的OMVs纳米疫苗就是通过脱氧胆酸处理而产生，但这种方法存在不小的缺点：OMVs在经脱氧胆酸处理后，会丧失TLR的激动剂——脂蛋白(Lipoprotein，Lpp)，从而降低OMVs的佐剂特性；其二是使用毒素降低的LPS突变菌株来产生OMVs，目前已经商品化的单磷酸类脂A(3D
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MPL)是一种安全有效的疫苗本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种猪霍乱沙门菌，其特征在于，所述猪霍乱沙门菌同时缺失pagL、pagP、lpxR基因，且在pagP突变位点插入有来源于弗朗西斯菌的脱磷酸酶基因lpxE；所述猪霍乱沙门菌为C500，C5001(C500 rpoS
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crp)和C5002(C500 rpoS
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fur)中的一种或多种。2.权利要求1所述的猪霍乱沙门菌的构建方法，其特征在于，将猪霍乱沙门菌应用自杀质粒pRE112介导的同源重组方法，同时缺失pagL、pagP、lpxR基因，然后在pagP突变位点插入来源于弗朗西斯菌的脱磷酸酶基因lpxE得到；所述猪霍乱沙门菌为C500，C5001(C500 rpoS+crp)和C5002(C500 rpoS+fur)中的一种或多种。3.一种外膜囊泡，其特征在于，所述外膜囊泡由权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘青，孔庆科，卞晓萍，罗海艳，刘程英，田镇源，李梦茹，刘欣雨，唐子芸，陈信，陈瑾，
申请(专利权)人：重庆微纳生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：