一种生产胞二磷胆碱的方法技术

本发明专利技术公开了一种生产胞二磷胆碱的方法，属于基因工程和微生物工程领域。本发明专利技术通过基因编辑技术敲除宿主细胞基因组上的dCTP脱氨酶基因dcd、磷酸核苷激酶基因ndk、核糖核苷三磷酸还原酶基因nrdD和/或三磷酸核苷焦磷酸水解酶基因mazG，并过量表达磷酸胆碱胞苷酰转移酶基因CCT和胆碱激酶基因CKI，并敲除宿主细胞基因组上的肽聚糖糖基转移酶基因mtgA，并将酿酒酵母来源的ScCCT酶进行定点突变提高酶活力，构建获得的重组大肠杆菌的胞二磷胆碱发酵水平可达28.3g/L以上。这种高效的重组菌株可用于实现胞二磷胆碱的工业化生产，利于降低其生产成本及环境污染，实现绿色生物制造。实现绿色生物制造。实现绿色生物制造。

【技术实现步骤摘要】
一种生产胞二磷胆碱的方法


[0001]本专利技术涉及一种生产胞二磷胆碱的方法，属于基因工程和微生物工程领域。

技术介绍

[0002]胞二磷胆碱，又名胞磷胆碱、尼古林、二磷酸胞嘧啶胆碱、胞嘧啶核苷二磷酸胆碱，为核苷衍生物。可改善头部外伤后或脑手术后意识障碍的意识状态及脑电图，促进脑卒中偏瘫病人的上肢运动功能的恢复，对促进大脑功能恢复、促进苏醒有一定作用。促进卵磷脂生物合成和抗磷脂酶A作用。与蛋白分解酶抑制剂合用，可保护及修复胰腺组织。
[0003]目前，胞磷胆碱的生产方法主要有化学合成法和生物合成法。化学合成法主要为前期的工业生产路线。化学合成法存在诸多缺点，例如：有毒有机化学试剂的使用、低转化率等，不适于大规模的生产。目前工业生产上主要采用啤酒酿造后产生的酿酒酵母渣，催化胞嘧啶核苷酸CMP和磷酸胆碱，酶法转化生产胞二磷胆碱。CN1944661A披露了一种利用啤酒酵母合成胞二磷胆碱的方法，转化率达65％，产品浓度最高仅达4g/L。但是此种方法的底物价格较为昂贵，同时这种酿造啤酒产生的酿酒酵母没有经过特异性改造与优化，其催化底物胞嘧啶核苷酸CMP和磷酸胆碱生产胞二磷胆碱的效率较低。固定化酵母细胞也被应用于胞二磷胆碱的催化生产(余东生等，无锡轻工大学学报，2002,21(3)：277
‑
280)。CN104774799A披露了一株表达胆碱激酶及磷酰胆碱胞苷转移酶的工程菌及其构建方法与应用，以乳清酸和磷酸胆碱为底物，添加葡萄糖，发酵生产胞二磷胆碱。但依然存在生产成本较高、转化率较低等问题。CN109207415B披露了一种生产胞二磷胆碱的重组微生物及生产胞二磷胆碱的方法，策略主要包括：敲除了胞二磷胆碱、胆碱、磷酸胆碱、CTP的降解基因，表达了胆碱激酶和胆碱磷酸胞苷酰转移酶，解除了嘧啶核苷途径合成反馈抑制，在5L发酵罐水平胞二磷胆碱达20g/L。但该方法依然存在生产成本较高、转化率较低等问题，主要体现在：发酵过程中使用昂贵的诱导剂IPTG会造成生产成本增加、重组菌中仍存在一些限速步骤会导致胞二磷胆碱偏低、细胞膜透性减低会导致补加的氯化胆碱很难高效进入细胞进而导致转化率偏低等。
[0004]胞二磷胆碱的市场需求量正在逐步扩大，存在极大的需求缺口。胞二磷胆碱的高效、高生产强度、低成本的工业化生产已经成为其急需解决的问题。更高效的胞二磷胆碱生产方法，对于提高生产强度、降低生产成本，具有重要意义。

技术实现思路

[0005][技术问题][0006]本专利技术要解决的技术问题是现有技术中缺少能够低成本、高转化率、高效生产胞二磷胆碱的重组菌株。
[0007][技术方案][0008]本专利技术采用基因敲除技术对大肠杆菌基因组上dCTP脱氨酶基因dcd进行敲除，切断由CTP催化生产UTP的路径，使CTP获得积累；采用基因敲除技术对大肠杆菌基因组上磷酸
核苷激酶基因ndk进行敲除，切断由CTP催化生产CDP的路径，使CTP获得积累；采用基因敲除技术对大肠杆菌基因组上核糖核苷三磷酸还原酶nrdD进行敲除；采用基因敲除技术对大肠杆菌基因组上三磷酸核苷焦磷酸水解酶基因mazG进行敲除，切断由CTP催化生产CMP的路径，使CTP获得积累；并过量表达磷酸胆碱胞苷酰转移酶基因CCT和胆碱激酶基因CKI，促进CTP至胞二磷胆碱的转化，敲除大肠杆菌基因组上的肽聚糖糖基转移酶基因mtgA，并将酿酒酵母来源的ScCCT酶进行突变，将111位的Val氨基酸残基突变为Ala，提高酿酒酵母来源的ScCCT酶活力，可以高效生产胞二磷胆碱，促进其在医药等领域中的应用。
[0009]本专利技术提供一种生产胞二磷胆碱的重组菌，以大肠杆菌为宿主细胞，敲除基因组上的dCTP脱氨酶编码基因dcd、磷酸核苷激酶编码基因ndk、核糖核苷三磷酸还原酶编码基因nrdD和/或三磷酸核苷焦磷酸水解酶编码基因mazG，并过量表达磷酸胆碱胞苷酰转移酶编码基因CCT和胆碱激酶编码基因CKI。
[0010]在一种实施方式中，所述重组菌还敲除了肽聚糖糖基转移酶编码基因mtgA。
[0011]在一种实施方式中，所述过量表达为将编码基因CCT和编码基因CKI整合至大肠杆菌基因组上。
[0012]在一种实施方式中，所述重组菌在yhdE位点整合编码基因CKI，在poxB位点整合编码编码基因CCT。
[0013]在一种实施方式中，所述大肠杆菌选自MG1655、DH5α、BL21(DE3)、JM109或HB101在一种实施方式中，所述大肠杆菌为MG1655。
[0014]在一种实施方式中，所述dCTP脱氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述磷酸核苷激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述核糖核苷三磷酸还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述三磷酸核苷焦磷酸水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
[0015]在一种实施方式中，所述dCTP脱氨酶编码基因dcd的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述磷酸核苷激酶编码基因ndk的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述核糖核苷三磷酸还原酶编码基因nrdD的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述三磷酸核苷焦磷酸水解酶编码基因mazG的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0016]在一种实施方式中，所述磷酸胆碱胞苷酰转移酶编码基因CCT的氨基酸序列如(a)或(b)所示：
[0017](c)氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；
[0018](d)在(a)的基础上将第111位的缬氨酸Val突变为丙氨酸Ala。
[0019]在一种实施方式中，所述磷酸胆碱胞苷酰转移酶编码基因CCT的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示或SEQ ID NO.15所示。
[0020]在一种实施方式中，所述胆碱激酶编码基因CKI的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。
[0021]在一种实施方式中，所述肽聚糖糖基转移酶编码基因mtgA的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
[0022]在一种实施方式中，所述yhdE位点的Gene ID:947753，所述poxB位点的Gene ID:946132。
[0023]本专利技术还提供一种生产胞二磷胆碱的方法，所述方法为将上述重组菌接种至含有碳源的反应体系中发酵。
[0024]在一种实施方式中，所述碳源为甘油或葡萄糖。
[0025]在一种实施方式中，所述发酵是将上述重组菌接种至含有LB培养基中培育得到种子液；将种子液转接至发酵培养基中，在20
‑
45℃和50
‑
350rpm条件下进行发酵培养，关联溶氧补料，当溶氧高于16
‑
55％时进行补料，采用氨水控制pH维持在6.5
‑
7.5；当发酵至菌浓OD
600
达30
‑
70时，连续补加氯化胆碱。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产胞二磷胆碱的重组菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主细胞，敲除基因组上的dCTP脱氨酶编码基因dcd、磷酸核苷激酶编码基因ndk、核糖核苷三磷酸还原酶编码基因nrdD和/或三磷酸核苷焦磷酸水解酶编码基因mazG，并过量表达磷酸胆碱胞苷酰转移酶编码基因CCT和胆碱激酶编码基因CKI。2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于，所述过量表达为将编码基因CCT和编码基因CKI整合至大肠杆菌基因组上。3.根据权利要求1或2所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌在yhdE位点整合编码基因CKI，在poxB位点整合编码编码基因CCT。4.根据权利要求1～3任一所述的重组菌，其特征在于，所述磷酸胆碱胞苷酰转移酶编码基因CCT的氨基酸序列如(a)或(b)所示：(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示；(b)在(a)的基础上将第111位的缬氨酸Val突变为丙氨酸Ala。5.根据权利要求1～4任一所述的重组菌，其特征在于，还敲除了肽聚糖糖基转...

【专利技术属性】
技术研发人员：张玮琪，张剑，
申请(专利权)人：江苏香地化学有限公司，
类型：发明
国别省市：