一种以木糖为原料合成中长链PHA的菌株及其构建方法和应用技术

本发明专利技术提供了一种以木糖为原料合成中长链PHA的菌株及其构建方法和应用，属于功能微生物技术领域。本发明专利技术构建以木糖为原料合成中长链PHA(mcl

【技术实现步骤摘要】
一种以木糖为原料合成中长链PHA的菌株及其构建方法和应用


[0001]本专利技术属于功能微生物
，具体涉及一种以木糖为原料合成中长链PHA的菌株及其构建方法和应用。

技术介绍

[0002]目前，大量塑料用于短期应用，除非有适当的废物回收与管理体系，否则所产生的废物会导致额外的环境破坏。例如，传统石化塑料所带来的残留物污染对于陆地和海洋生物的生存都产生了极大的威胁，同时由于其极难降解，对于环境和人类健康也是极大的隐患；而可降解的生物塑料则可大大减少这种危害。总之，石化塑料是不可持续的，应该开发生物基可降解塑料，以避免石化塑料造成的种种问题。
[0003]聚羟基脂肪酸酯(polyhydroxyalkanoate,PHA)是一类由多种微生物生产的生物可降解高分子材料，由于其优越的物理化学性质和材料学特性，可用作包装和组织工程材料。根据单体的链长，PHA可分为两类，即短链PHA(scl
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PHA)和中长链PHA(mcl
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PHA)。因mcl
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PHA独特的理化和材料特性而比scl
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PHA具有更广泛的应用范围。恶臭假单胞菌KT2440(P.putida KT2440)是一株生物安全的环境微生物，并且具有成熟的遗传操作系统，因而被越来越多地用作以各种生物技术为目的的外源代谢途径表达的最优底盘。而且，P.putida KT2440能够以葡萄糖、脂肪酸和甘油作为碳源生产mcl
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PHA。目前，mcl
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PHA的应用受到限制主要是因为较高的生产成本，而原材料的成本(主要是碳源)大概占其总生产成本的50％以上。通过利用价格低廉的底物，比如木质纤维素水解物中的木糖，是降低底物成本的有效手段。然而，目前还没有关于能够利用木糖生产mcl
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PHA的微生物菌株的报道。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种以木糖为原料合成mcl
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PHA的菌株及其构建方法，为降低mcl
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PHA生产成本提供有效手段。
[0005]本专利技术的目的还在于提供一种以木糖合成mcl
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PHA的生产方法，大大降低mcl
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PHA的生产成本，有利于推动mcl
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PHA的实际应用。
[0006]本专利技术提供了一种以木糖为原料合成中长链PHA的菌株，以恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)菌株为基础菌株，含有木糖代谢途径基因和磷酸戊糖途径基因组成的木糖代谢模块；
[0007]所述木糖代谢途径基因由木糖异构酶基因和木酮糖激酶基因组成或由木糖异构酶基因、木酮糖激酶基因和木糖转运蛋白基因组成；
[0008]所述磷酸戊糖途径基因包括转醛醇酶基因和转酮醇酶基因。
[0009]优选的，所述木糖异构酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
[0010]所述木酮糖激酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；
[0011]所述木糖转运蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
[0012]所述转醛醇酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
[0013]所述转酮醇酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
[0014]优选的，所述木糖代谢模块中包含P13启动子。
[0015]优选的，所述恶臭假单胞菌菌株包括以下一种或几种：恶臭假单胞菌KT2440菌株和恶臭假单胞菌KTU
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U27精简菌株和恶臭假单胞菌KTU
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U27Δgcd
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P46CA菌株；
[0016]所述恶臭假单胞菌KTU
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U27精简菌株是在恶臭假单胞菌KTU
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U13菌株的基础上敲除基因组岛序列；
[0017]所述恶臭假单胞菌KTU
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U27Δgcd
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P46CA菌株是在所述恶臭假单胞菌KTU
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U27精简菌株的基础上敲除葡萄糖脱氢酶基因，同时用P46启动子强化PHA合酶操纵子和丙酮酸脱氢酶基因的表达。
[0018]本专利技术提供了一种所述以木糖为原料合成中长链PHA的菌株的构建方法，包括以木糖为原料合成中长链PHA的菌株的构建方法；
[0019]所述以木糖为原料合成中长链PHA的菌株的构建方法，以下步骤：
[0020]1)构建含由木糖异构酶基因和木酮糖激酶基因组成的木糖代谢基因或由木糖异构酶基因、木酮糖激酶基因和木糖转运蛋白基因组成的木糖代谢基因的重组质粒；
[0021]2)将步骤1)中重组质粒转入恶臭假单胞菌菌株中，形成重组菌株；
[0022]3)将磷酸戊糖途径基因整合至所述重组菌株的基因组中，得到以木糖为原料合成中长链PHA的菌株；
[0023]优选的，步骤1)中，构建方法为用引物Y
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UF、Y
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UR及Y
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DF、Y
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DR扩增出基因组插入位点上下游同源臂UP和DN，利用同源重组的方法将插入片段Y及上下游同源臂同时整合到自杀质粒pKU的EcoR I位点，构建得到基因片段插入载体pKU
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Y；
[0024]所述插入片段Y为由木糖异构酶基因和木酮糖激酶基因组成木糖代谢基因、由木糖异构酶基因、木酮糖激酶基因和木糖转运蛋白基因组成的木糖代谢基因。
[0025]优选的，当所述插入片段Y为由木糖异构酶基因和木酮糖激酶基因组成的木糖代谢基因时，所述插入片段Y由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2组成；
[0026]所述插入片段Y为由木糖异构酶基因、木酮糖激酶基因和木糖转运蛋白基因组成的木糖代谢基因时，所述插入片段Y由SEQ ID NO:1，SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3组成；
[0027]本专利技术提供了所述菌株在以木糖为碳源发酵生产中长链PHA中的应用。
[0028]本专利技术提供了一种以木糖为碳源发酵生产中长链PHA的方法，包括以下步骤：
[0029]将所述菌株经过驯化培养，接种至以木糖为碳源的发酵培养基中，经好氧发酵，得到中长链PHA；
[0030]所述驯化培养，先将所述菌株接种入驯化培养基中培养，所得菌液再次接入发酵培养基中培养；
[0031]所述驯化培养培养基为17.11g/LNa2HPO4·
12H2O、3.0g/LKH2PO4、1.0g/LNH4Cl、0.5g/LNaCl、1μL/L微量元素液、碳源和104.4g/LMgSO4，pH值为7.0～7.2；所述微量元素液包括以下含量成分：0.1mol/L HCl、9.7g FeCl3、7.8g CaCl2、0.218g CoCl2·
6H2O、0.156g CuSO4·
5H2O、0.118g NiCl2、0.105g CrCl3本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种以木糖为原料合成中长链PHA的菌株，其特征在于，以恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)菌株为基础菌株，含有木糖代谢途径基因和磷酸戊糖途径基因组成的木糖代谢模块；所述木糖代谢途径基因由木糖异构酶基因和木酮糖激酶基因组成或由木糖异构酶基因、木酮糖激酶基因和木糖转运蛋白基因组成；所述磷酸戊糖途径基因包括转醛醇酶基因和转酮醇酶基因。2.根据权利要求1所述以木糖为原料合成中长链PHA的菌株，其特征在于，所述木糖异构酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述木酮糖激酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示；所述木糖转运蛋白基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；所述转醛醇酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；所述转酮醇酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。3.根据权利要求1所述以木糖为原料合成中长链PHA的菌株，其特征在于，所述木糖代谢模块包含P13启动子。4.根据权利要求1～3任意一项所述以木糖为原料合成中长链PHA的菌株，其特征在于，所述恶臭假单胞菌菌株包括以下一种或几种：恶臭假单胞菌KT2440菌株和恶臭假单胞菌KTU
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U27精简菌株和恶臭假单胞菌KTU
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U27Δgcd
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P46CA菌株；所述恶臭假单胞菌KTU
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U27精简菌株是在恶臭假单胞菌KTU
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U13菌株的基础上敲除基因组岛序列；所述恶臭假单胞菌KTU
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U27Δgcd
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P46CA菌株是在所述恶臭假单胞菌KTU
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U27精简菌株的基础上敲除葡萄糖脱氢酶基因，同时用P46启动子强化PHA合酶操纵子和丙酮酸脱氢酶基因的表达。5.一种权利要求1～4任意一项所述以木糖为原料合成中长链PHA的菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：1)构建含由木糖异构酶基因和木酮糖激酶基因组成的木糖代谢基因或由木糖异构酶基因、木酮糖激酶基因和木糖转运蛋白基因组成的木糖代谢基因的重组质粒；2)将步骤1)中重组质粒转入恶臭假单胞菌菌株中，形成重组菌株；3)将磷酸戊糖途径基因整合至所述重组菌株的基因组中，得到以木糖为原料合成中长链PHA的菌株。6.根据权利要求5所述构建方法，其特征在于，步骤1)中，所述构建的方法为用引物Y
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UF、Y
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UR及Y
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DF、Y
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【专利技术属性】
技术研发人员：王淑芳，杨超，刘红露，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：