一种高效生产胞苷酸的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种高效生产胞苷酸的方法及应用，属于生物技术领域

【技术实现步骤摘要】
一种高效生产胞苷酸的方法及应用


[0001]本专利技术涉及一种高效生产胞苷酸的方法及应用，属于生物

。

技术介绍

[0002]胞苷5’‑
单磷酸
(
简称5’‑
CMP)
属于胞嘧啶核苷酸的一种，是
RNA
的结构成分之一
。5
’‑
CMP
应用于不同的领域，它可作为药物合成的前体或中间体应用于医药领域，也可作为食品营养强化剂应用于食品领域，是一种重要的核苷酸
。
在食品领域，5’‑
CMP
是一种重要的增鲜剂，可以添加到味精等调味品中，提高食品的鲜味，在节约粮食方面具有重大意义；在医药领域，5’‑
CMP
在生物医药行业中是合成核苷酸药物的关键中间体，在核苷酸药物中，例如三磷酸胞苷
、
胞嘧啶
β
‑
D
‑
呋喃阿拉伯糖苷
、
二磷酸胞嘧啶胆碱和聚肌苷酸
‑
聚胞苷酸等的生产都需要5’‑
CMP
作中间体
。
在人体和哺乳动物的免疫系统中，5’‑
CMP
发挥重要作用
。
研究表明，添加5’‑
CMP
的婴幼儿奶粉的功效更接近母乳，与未添加5’‑
CMP
婴幼儿奶粉相比，能够明显提高婴幼儿的免疫力
。
[0003]目前，生产5’‑
CMP
的方法主要包括：酵母核酸水解法
、
化学合成法
、
酶合成法和生物发酵法
。
酵母核酸水解法传统方法利用
RNA
制备5’‑
CMP
，包括核酸化学水解法和利用核酸水解酶水解法
。
常用的核酸水解酶是5’‑
磷酸二酯酶，利用5’‑
磷酸二酯酶
(5
’‑
PDE)
水解酵母
RNA
制备风味核苷酸和其他具有医用价值的核苷酸，再经离子交换法分离获得相应的核苷单磷酸盐
。
化学水解法是将酵母
RNA
在强酸溶液
(
硫酸或硝酸
)
中脱氨制备胞苷酸或尿苷酸
。
核酸水解法在原材料来源和反应条件等方面具有较大优势，但该方法存在反应时间长，水解后得到的四种核苷酸混合物分离工序复杂，且成本高等问题
。
化学合成法主要是利用甲基化的核苷与磷酸或者焦磷酸发生磷酸化反应，如利用2’
,3
’‑
异丙基亚甲基核苷与磷酰氯发生磷酸化反应，合成5’‑
核苷酸，在反应前加入少量水，可大大提高核苷酸的产率
。
另外，用三烷基磷酸酯替代磷酰氯，和核苷发生磷酸化反应也可以获得相应的核苷酸产物
。
化学合成法所需试剂成本高，反应后的废水对环境存在污染
。
尿苷
‑
胞苷激酶是生物体嘧啶核苷酸代谢补救途径中的重要催化剂，它可以使胞苷
/
尿苷磷酸化生成5’‑
CMP
，但需要
NTP
为该反应提供磷酸基团
。
已报道的在大肠杆菌
(Escherichia coli)、
保加利亚乳杆菌
(Lactobacillus bulgaricus)
和枯草芽孢杆菌
(Bacillus subtilis)
中尿苷和胞苷进行磷酸化反应时，需要
GTP
为该反应提供磷酸基团，但是
GTP
的采购成本过高
。
[0004]生物发酵法是依靠微生物的发酵作用合成所需要的物质，微生物发酵法合成具有条件简单
、
生长周期短
、
生产产品成本高
、
发酵条件易于控制
、
产量高
、
生产原料成本低等优点，适合大规模工业化生产
。
前期调研中，关于5’‑
CMP
下游代谢产物胞苷的微生物生产方面的研究较多，但对于5’‑
CMP
的微生物生产研究较少
。
微生物中有两种途径来合成单磷酸胞苷，从头合成途径和嘧啶补救途径
。
嘧啶补救途径是细胞直接从外部环境吸收胞嘧啶或者脱氧胞苷三磷酸经转化得到胞苷，胞苷再经尿苷胞苷激酶生成5’‑
CMP。5
’‑
CMP
从头合成途径是以谷氨酰胺
、
碳酸和
ATP
为原料，在一系列酶的作用下，经过一系列反应，生成
UMP。
在嘧啶核苷酸代谢途径中，
UMP
是合成所有嘧啶核苷酸的前体物质，经过一系列胺化水解反应最
终合成5’‑
CMP。
在野生菌株中，5’‑
CMP
的积累量非常低，这是因为5’‑
CMP
属于嘧啶核苷酸代谢产物，嘧啶核苷酸代谢还包括
UMP、UTP、CTP、CDP
等，这些物质均是
DNA
或
RNA
的组成物质，具有复杂的调控机制
。
随着微生物学技术的发展，微生物的嘧啶核苷酸代谢机制逐渐清晰，利用微生物从头合成尿苷和胞苷的研究逐渐增多，清晰的代谢路径以及调控机制为研究微生物通过代谢工程生产5’‑
CMP
提供了理论依据
。
[0005]CN 111269870 A
披露了一种高产胞苷酸的重组大肠杆菌及其应用，从胞苷酸生产菌株中克隆得到的胞苷激酶基因，重组菌经破碎后得到的粗酶液有着良好的催化活性和稳定性，加入胞苷
、
三磷酸腺苷
(ATP)
以及
Mg
2+
，反应得到胞苷酸
。
但，该方法需要对重组菌进行破碎
、
再对酶进行分离，且产量不高
。CN 202111280840.4
披露了一种生产5’‑
胞苷酸的方法，基因敲除技术对大肠杆菌的胞苷单磷酸焦磷酸化酶基因
ushA
和核苷酸
5'
‑
单磷酸核苷酶基因
ppnN
进行敲除，并通过过量表达尿苷激酶基因
udk
，获得可积累5’‑
胞苷酸
(5
’‑
CMP)
的大肠杆菌突变体
。
但，上述重组菌株积累5’‑
CMP
时需要诱导剂
IPTG
和抗生素的补加，该诱导剂和抗生素价格昂贵且对细胞有毒性，同时如果5’‑
胞苷酸
(5
’‑
CMP)
的积累浓度进一步获得提高，将进一步促进其工业化生本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.
一种生产胞苷酸的重组大肠杆菌，其特征在于，在出发菌株中过表达天门冬氨酸氨基甲酰转移酶
pyrB、
二氢乳清酸酶
pyrC、
嘧啶特异性氨甲酰磷酸合成酶
pyrAA、
嘧啶特异性氨甲酰磷酸合成酶
pyrAB
‑
E949、
二氢乳清酸脱氢酶
pyrK、
二氢乳清酸脱氢酶
pyrD、
乳清苷酸脱羧酶
pyrF
和乳清酸磷酸核糖基转移酶
pyrE。2.
如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，在出发菌株的基因组上整合枯草芽孢杆菌的嘧啶操纵子
pyr_Bs
，所述嘧啶操纵子
pyr_Bs
的基因簇依次包括
pyrB、pyrC、pyrAA、pyrAB
‑
E949、pyrK、pyrD、pyrF
和
pyrE。3.
如权利要求1所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述
pyrB
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.1
所示，所述
pyrC
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.2
所示，所述
pyrAA
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.3
所示，所述
pyrAB
‑
E949
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.4
所示，所述
pyrK
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.5
所示，所述
pyrD
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.6
所示，所述
pyrF
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.7
所示，所述
pyrE
的核苷酸序列如
SEQ ID NO.8
所示
。4.
如权利要求1～3任一所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述嘧啶操纵子
pyr_Bs
整合在基因
yghX
或
pta
所在位置
。5.
如权利要求4所述的重组大肠杆菌，其特征在于，所述出发菌株以
E.coli MG1655
为底盘细胞，敲除了基因组上的核苷酸
5'
‑
单磷酸核苷酶基因
ppnN
，胞苷单磷酸焦磷酸化酶基因
ushA、
嘌呤核苷酸酶基因
yrfG、
嘧啶5’...

【专利技术属性】
技术研发人员：张玮琪，董田田，
申请(专利权)人：江苏香地化学有限公司，
类型：发明
国别省市：