【技术实现步骤摘要】
生产目标物质的方法、转基因微生物及核酸的应用
[0001]本专利技术是2019年9月6日所提出的申请号为201980069550.X、专利技术名称为《生产目标物质的方法》的专利技术专利申请的分案申请。
[0002]本申请基于2019年4月12日在日本专利厅提交的日本专利申请No.JP2019
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76629(日本专利特愿2019
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76629)而主张优先权,所述日本专利申请的内容出于所有目的而援用于本说明书中。
[0003]本专利技术涉及一种转基因微生物、以及使用其的物质的生产方法,所述转基因微生物的乳酸脱氢酶活性、琥珀酸脱氢酶活性或富马酸还原酶活性等规定的酶活性经降低或失活,且具有相对于由天冬氨酸引起的反馈抑制而显示出抵抗性的修饰型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性。
技术介绍
[0004]在使用微生物的物质生产技术中,进行了如下的提高多种目标物质的生产效率的尝试:在参与由植物来源的糖产生目标物质的过程的代谢体系中,利用转基因技术等来强化代谢酶的活性,或者使一部分代谢酶的活性失活等。例如,关于很多氨基酸,利用此种技术且使用微生物的生产正在以商用水平进行。
[0005]另一方面,也存在由石油来源的原料制作的氨基酸。例如,在广泛用于医疗品、食品添加剂、人工甜味剂等中利用的天冬苯丙二肽酯(aspartame)及作为生物降解性树脂的聚天冬胺酸的原料等中的天冬胺酸的工业生产中,使用由石油大量且廉价地合成的富马酸作为原料。更详细而言,采用的是如下方法:在如上所述由石油合成的富马酸 ...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种属于棒状杆菌属的转基因微生物,满足所有下述条件(I)~条件(III):条件(I)与所述转基因微生物的对应野生型微生物相比,琥珀酸脱氢酶活性经降低或失活;条件(II)与所述野生型微生物相比,乳酸脱氢酶活性经降低或失活;条件(III)具有变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性或外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性,所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性相对于野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性中的由天冬氨酸引起的反馈抑制而显示出抵抗性,所述外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性与所述野生型微生物显示出的野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性相比,相对于由天冬氨酸引起的反馈抑制的抵抗性更高。2.根据权利要求1所述的转基因微生物,其中,所述转基因微生物对属于细菌来源的所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶进行编码的核酸以能够表达所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的形态导入,所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶具有使所述转基因微生物满足条件(III)的至少一个氨基酸变异。3.根据权利要求2所述的转基因微生物,其中,所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶是属于棒状杆菌属的细菌来源的变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶,所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶具有使所述转基因微生物满足条件(III)的至少二个氨基酸变异,所述至少二个氨基酸变异以序列号2所示的氨基酸序列为基准,且包括下述(a)所示的氨基酸置换,以及选自由下述(c)、(e)或(f)所示的氨基酸置换:(a)相当于第299位的天冬氨酸的氨基酸向天冬酰胺的氨基酸的氨基酸置换;(c)相当于第813位的赖氨酸的氨基酸向丝氨酸的氨基酸的氨基酸置换;(e)相当于第873位的精氨酸的氨基酸向丝氨酸的氨基酸的氨基酸置换;(f)相当于第917位的天冬酰胺的氨基酸向甘氨酸的氨基酸的氨基酸置换。4.根据权利要求3所述的转基因微生物,其中,所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶中的所述至少二个氨基酸变异包括所述(a)所示的氨基酸置换,以及所述(c)或是所述(f)所示的氨基酸置换。5.根据权利要求1所述的转基因微生物,其中,所述转基因微生物为谷氨酸棒状杆菌的转基因菌株。6.根据权利要求1所述的转基因微生物,进而,作为条件(IV),与所述野生型微生物相比,丙酮酸:醌氧化还原酶经降低或失活。7.根据权利要求6所述的转基因微生物,其中所述丙酮酸:醌氧化还原酶的基因失活或被破坏。8.根据权利要求1所述的转基因微生物,其中,所述琥珀酸脱氢酶的基因失活或被破坏,且所述乳酸脱氢酶的基因失活或被破坏。9.一种生产目标物质的方法,所述目标物质是天冬氨酸或由所述天冬氨酸衍生的代谢物,其中所述方法包括:(p)使用根据权利要求1至8中任一项所述的转基因微生物的菌体或其菌体处理物生成目标物质;以及(q)回收所述目标物质。10.根据权利要求9所述的方法,其中,所述目标物质为天冬氨酸、β丙氨酸或天冬酰胺。
11.一种属于埃希菌属的转基因微生物,满足所有下述条件(I)~条件(III):条件(I)与所述转基因微生物的对应野生型微生物相比,富马酸还原酶活性经降低或失活;条件(II)与所述野生型微生物相比,乳酸脱氢酶活性经降低或失活;条件(III)具有变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性或外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性,所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性相对于野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性中的由天冬氨酸引起的反馈抑制而显示出抵抗性,所述外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性与所述野生型微生物显示出的野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性相比,相对于由天冬氨酸引起的反馈抑制的抵抗性更高。12.根据权利要求11所述的转基因微生物,其中,所述转基因微生物对属于细菌来源的所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶进行编码的核酸以能够表达所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的形态导入,所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶具有使所述转基因微生物满足条件(III)的至少一个氨基酸变异。13.根据权利要求12所述的转基因微生物,其中,所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶是属于棒状杆菌属的细菌来源的变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶,所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶具有使所述转基因微生物满足条件(III)的至少二个氨基酸变异,所述至少二个氨基酸变异以序列号2所示的氨基酸序列为基准,且包括下述(a)所示的氨基酸置换,以及选自由下述(c)、(e)或(f)所示的氨基酸置换:(a)相当于第299位的天冬氨酸的氨基酸向天冬酰胺的氨基酸的氨基酸置换;(c)相当于第813位的赖氨酸的氨基酸向丝氨酸的氨基酸的氨基酸置换;(e)相当于第873位的精氨酸的氨基酸向丝氨酸的氨基酸的氨基酸置换;(f)相当于第917位的天冬酰胺的氨基酸向甘氨酸的氨基酸的氨基酸置换。14.根据权利要求13所述的转基因微生物,其中,所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶中的所述至少二个氨基酸变异包括所述(a)所示的氨基酸置换,以及所述(c)或是所述(f)所示的氨基酸置换。15.根据权利要求11所述的转基因微生物,其中,所述转基因微生物为属于大肠埃希菌的转基因菌株。16.根据权利要求11所述的转基因微生物,进而,作为条件(V):与所述野生型微生物相比,丙酮酸甲酸裂合酶活性经降低或失活。17.根据权利要求16所述的转基因微生物,其中所述丙酮酸甲酸裂合酶的基因失活或被破坏。18.根据权利要求11所述的转基因微生物,进而,作...
【专利技术属性】
技术研发人员:中屋敷彻,
申请(专利权)人:绿色地球研究所株式会社,
类型:发明
国别省市:
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