生产目标物质的方法、转基因微生物及核酸的应用技术

本公开涉及一种使用满足规定条件中的若干条件的转基因微生物、其菌体或其菌体处理物生成目标物质的方法以及其在核酸的应用。所述规定条件包括：(I)与野生型微生物相比，琥珀酸脱氢酶活性或富马酸还原酶活性经降低或失活；(II)与野生型微生物相比，乳酸脱氢酶活性经降低或失活；(III)具有修饰型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性或外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性，所述修饰型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性相对于野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性中的由天冬氨酸引起的反馈抑制而显示出抵抗性，所述外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性与野生型微生物显示出的野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性相比，相对于由天冬氨酸引起的反馈抑制的抵抗性更高。更高。更高。

【技术实现步骤摘要】
生产目标物质的方法、转基因微生物及核酸的应用
[0001]本专利技术是2019年9月6日所提出的申请号为201980069550.X、专利技术名称为《生产目标物质的方法》的专利技术专利申请的分案申请。
[0002]本申请基于2019年4月12日在日本专利厅提交的日本专利申请No.JP2019
‑
76629(日本专利特愿2019
‑
76629)而主张优先权，所述日本专利申请的内容出于所有目的而援用于本说明书中。


[0003]本专利技术涉及一种转基因微生物、以及使用其的物质的生产方法，所述转基因微生物的乳酸脱氢酶活性、琥珀酸脱氢酶活性或富马酸还原酶活性等规定的酶活性经降低或失活，且具有相对于由天冬氨酸引起的反馈抑制而显示出抵抗性的修饰型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性。

技术介绍

[0004]在使用微生物的物质生产技术中，进行了如下的提高多种目标物质的生产效率的尝试：在参与由植物来源的糖产生目标物质的过程的代谢体系中，利用转基因技术等来强化代谢酶的活性，或者使一部分代谢酶的活性失活等。例如，关于很多氨基酸，利用此种技术且使用微生物的生产正在以商用水平进行。
[0005]另一方面，也存在由石油来源的原料制作的氨基酸。例如，在广泛用于医疗品、食品添加剂、人工甜味剂等中利用的天冬苯丙二肽酯(aspartame)及作为生物降解性树脂的聚天冬胺酸的原料等中的天冬胺酸的工业生产中，使用由石油大量且廉价地合成的富马酸作为原料。更详细而言，采用的是如下方法：在如上所述由石油合成的富马酸中加入氨，使微生物所产生的天冬氨酸酶作用于此，由此合成天冬氨酸。现在，一般而言利用k
‑
卡拉胶将具有高天冬酶活性的大肠杆菌固定化来进行连续酶反应。但现状是，在1973年旧田边制药股份有限公司确立了此手法之后，在此领域中一直未发生大的技术革新。
[0006]而且，现状是，关于利用包括微生物发酵的生物工程学手法而能够从作为比富马酸廉价的碳源的葡萄糖生产天冬氨酸的技术开发的报告，数量少。若强行举例，则其大部分仅限于涉及使用天冬氨酸脱氢酶的手法的报告。
[0007]例如，在专利文献1中，记载了一种变异型天冬氨酸脱氢酶及使用其的L
‑
天冬氨酸制造方法，通过对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)来源的天冬氨酸脱氢酶导入变异而提高了酶活性。专利文献1中记载的L
‑
天冬氨酸制造方法实际上采用的是以下手法：对大肠杆菌中表达出的所述变异型天冬氨酸脱氢酶进行精制，并使用精制后的变异型酶在体外(in vitro)酶反应体系中生成天冬氨酸。因此，专利文献1中记载的方法严格来说不能称为天冬氨酸的发酵生产技术。
[0008]进而，对更适合于发酵生产的天冬氨酸脱氢酶也在进行探索，例如，在专利文献2中，发现了一种即便在常温下也发挥高催化剂活性的、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)PA01株或富养罗尔斯通氏菌(Ralstonia eutropha)JM134株来源的天冬氨酸
脱氢酶，并公开了一种使用所述天冬氨酸脱氢酶的L
‑
天冬氨酸制造方法。更详细而言，在专利文献2中记载了：通过对表达所述规定的天冬氨酸脱氢酶的大肠杆菌进行甲苯处理而制备酶混合物，使用所述酶混合物并利用体外酶法制造天冬氨酸；以及使用导入有所述规定的天冬氨酸脱氢酶的大肠杆菌，通过以琥珀酸为基质的培养发酵来生产天冬氨酸。在专利文献2中，记载了在所述培养发酵中即便使用柠檬酸或葡萄糖来代替作为基质的琥珀酸，也确认到天冬氨酸的生成，但并未示出从这些基质向天冬氨酸的转换效率或反应速度等任何具体的数据，关于专利文献2中公开的技术是否能够称为适合于天冬氨酸的工业生产的技术，有诸多疑问。
[0009]此外，在专利文献2的
技术介绍
一项中，记载了若使用专利文献3中公开的古细菌闪烁古生球菌(Archaeoglobus fulgidus)来源的天冬氨酸脱氢酶，则能够获得天冬氨酸，但在专利文献2及专利文献3的任一者中，均未记载使用所述闪烁古生球菌来源的天冬氨酸脱氢酶实际制造出了天冬氨酸。
[0010]进而，在专利文献4中，公开了一种肠内细菌科细菌、及使用所述细菌制造L
‑
天冬氨酸或由所述L
‑
天冬氨酸衍生的代谢产物的方法，通过导入天冬氨酸脱氢酶来生产L
‑
天冬氨酸或由所述L
‑
天冬氨酸衍生的代谢产物。具体而言，专利文献4中公开的细菌是通过在大肠埃希菌(Escherichia coli)(大肠杆菌)等中导入来源于海栖热袍菌(Thermotoga maritima)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacterium glutamicum)等的各种异种性天冬氨酸脱氢酶基因而获得的重组体。在专利文献4中示出了：根据通过此种异种性天冬氨酸脱氢酶基因的导入而赋予了所述酶活性的大肠杆菌，L
‑
天冬氨酸及其下游的代谢产物可得到一定程度的增加。
[0011]现有技术文献
[0012]专利文献
[0013]专利文献1：日本专利特开2006
‑
254795号公报
[0014]专利文献2：日本专利特开2010
‑
183860公报
[0015]专利文献3：日本专利特开2006
‑
254730号公报
[0016]专利文献4：日本专利特表2013
‑
516958公报
[0017]专利文献5：日本专利特开2007
‑
43947公报
[0018]专利文献6：日本专利特开平8
‑
70860公报
[0019]专利文献7：日本专利特表2003
‑
503064公报
[0020]非专利文献
[0021]非专利文献1：利萨诺夫B、卡布斯A、布罗克M、博特M(Litsanov B、Kabus A、Brocker M、Bott M).微生物生物技术(Microbial Biotechnology，Microb Biotechnol).2012年1月(2012Jan)；5(1)：116
‑
28.
[0022]非专利文献2：陈振、布玛莱迪RR、弗兰克D、拉佩特S、曾AP(Chen Z，Bommareddy RR，Frank D，Rappert S，Zeng AP).应用与环境微生物学(Applied and Environmental Microbiology，Appl Environ Microbiol).2014年2月(2014Feb)；80(4)：1388
‑
93.
[0023]非专利文献3：和田M、泽田K、小仓K、下野Y、萩原T、杉本M、小贯A、横田A(Wada M、Sawada K、Ogura K、Shimono Y、Hagiwara T、Sugimoto M、Onuki A、Yoko本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种属于棒状杆菌属的转基因微生物，满足所有下述条件(I)～条件(III)：条件(I)与所述转基因微生物的对应野生型微生物相比，琥珀酸脱氢酶活性经降低或失活；条件(II)与所述野生型微生物相比，乳酸脱氢酶活性经降低或失活；条件(III)具有变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性或外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性相对于野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性中的由天冬氨酸引起的反馈抑制而显示出抵抗性，所述外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性与所述野生型微生物显示出的野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性相比，相对于由天冬氨酸引起的反馈抑制的抵抗性更高。2.根据权利要求1所述的转基因微生物，其中，所述转基因微生物对属于细菌来源的所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶进行编码的核酸以能够表达所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的形态导入，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶具有使所述转基因微生物满足条件(III)的至少一个氨基酸变异。3.根据权利要求2所述的转基因微生物，其中，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶是属于棒状杆菌属的细菌来源的变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶具有使所述转基因微生物满足条件(III)的至少二个氨基酸变异，所述至少二个氨基酸变异以序列号2所示的氨基酸序列为基准，且包括下述(a)所示的氨基酸置换，以及选自由下述(c)、(e)或(f)所示的氨基酸置换：(a)相当于第299位的天冬氨酸的氨基酸向天冬酰胺的氨基酸的氨基酸置换；(c)相当于第813位的赖氨酸的氨基酸向丝氨酸的氨基酸的氨基酸置换；(e)相当于第873位的精氨酸的氨基酸向丝氨酸的氨基酸的氨基酸置换；(f)相当于第917位的天冬酰胺的氨基酸向甘氨酸的氨基酸的氨基酸置换。4.根据权利要求3所述的转基因微生物，其中，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶中的所述至少二个氨基酸变异包括所述(a)所示的氨基酸置换，以及所述(c)或是所述(f)所示的氨基酸置换。5.根据权利要求1所述的转基因微生物，其中，所述转基因微生物为谷氨酸棒状杆菌的转基因菌株。6.根据权利要求1所述的转基因微生物，进而，作为条件(IV)，与所述野生型微生物相比，丙酮酸：醌氧化还原酶经降低或失活。7.根据权利要求6所述的转基因微生物，其中所述丙酮酸：醌氧化还原酶的基因失活或被破坏。8.根据权利要求1所述的转基因微生物，其中，所述琥珀酸脱氢酶的基因失活或被破坏，且所述乳酸脱氢酶的基因失活或被破坏。9.一种生产目标物质的方法，所述目标物质是天冬氨酸或由所述天冬氨酸衍生的代谢物，其中所述方法包括：(p)使用根据权利要求1至8中任一项所述的转基因微生物的菌体或其菌体处理物生成目标物质；以及(q)回收所述目标物质。10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述目标物质为天冬氨酸、β丙氨酸或天冬酰胺。
11.一种属于埃希菌属的转基因微生物，满足所有下述条件(I)～条件(III)：条件(I)与所述转基因微生物的对应野生型微生物相比，富马酸还原酶活性经降低或失活；条件(II)与所述野生型微生物相比，乳酸脱氢酶活性经降低或失活；条件(III)具有变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性或外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性相对于野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性中的由天冬氨酸引起的反馈抑制而显示出抵抗性，所述外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性与所述野生型微生物显示出的野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性相比，相对于由天冬氨酸引起的反馈抑制的抵抗性更高。12.根据权利要求11所述的转基因微生物，其中，所述转基因微生物对属于细菌来源的所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶进行编码的核酸以能够表达所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的形态导入，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶具有使所述转基因微生物满足条件(III)的至少一个氨基酸变异。13.根据权利要求12所述的转基因微生物，其中，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶是属于棒状杆菌属的细菌来源的变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶具有使所述转基因微生物满足条件(III)的至少二个氨基酸变异，所述至少二个氨基酸变异以序列号2所示的氨基酸序列为基准，且包括下述(a)所示的氨基酸置换，以及选自由下述(c)、(e)或(f)所示的氨基酸置换：(a)相当于第299位的天冬氨酸的氨基酸向天冬酰胺的氨基酸的氨基酸置换；(c)相当于第813位的赖氨酸的氨基酸向丝氨酸的氨基酸的氨基酸置换；(e)相当于第873位的精氨酸的氨基酸向丝氨酸的氨基酸的氨基酸置换；(f)相当于第917位的天冬酰胺的氨基酸向甘氨酸的氨基酸的氨基酸置换。14.根据权利要求13所述的转基因微生物，其中，所述变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶中的所述至少二个氨基酸变异包括所述(a)所示的氨基酸置换，以及所述(c)或是所述(f)所示的氨基酸置换。15.根据权利要求11所述的转基因微生物，其中，所述转基因微生物为属于大肠埃希菌的转基因菌株。16.根据权利要求11所述的转基因微生物，进而，作为条件(V)：与所述野生型微生物相比，丙酮酸甲酸裂合酶活性经降低或失活。17.根据权利要求16所述的转基因微生物，其中所述丙酮酸甲酸裂合酶的基因失活或被破坏。18.根据权利要求11所述的转基因微生物，进而，作...

【专利技术属性】
技术研发人员：中屋敷彻，
申请(专利权)人：绿色地球研究所株式会社，
类型：发明
国别省市：