本发明专利技术提供一种高产莫匹罗星的荧光假单胞菌基因工程菌株及制作方法，该基因工程菌株是通过敲除荧光假单胞菌2P24中spoT、relA、mvaT和rsaL基因后而获得,它可使莫匹罗星的发酵产量由3mg/mL提升到了15mg/mL，为降低莫匹罗星的生产成本提供了坚实基础。罗星的生产成本提供了坚实基础。罗星的生产成本提供了坚实基础。
【技术实现步骤摘要】
一种高产莫匹罗星的荧光假单胞菌基因工程菌株及制作方法
[0001]本专利技术属于基因工程
，特别涉及一种高产莫匹罗星的荧光假单胞菌基因工程菌株及制作方法。
技术介绍
[0002]莫匹罗星(mupirocin)，也被称为假单胞菌酸A，是一种局部外用的广谱医用类抗生素，可抑制肺炎克氏杆菌(Klebsiella pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)等革兰氏阳性细菌以及大肠埃希氏菌(Escherichia coli)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)和淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)等革兰氏阴性细菌的生长。莫匹罗星的作用机制是通过抑制病原菌中异亮氨酸
‑
tRNA合酶的活性，影响肽链的合成，从而起到抑菌或杀菌的作用。
[0003]莫匹罗星由荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)产生，其表达受到多个遗传因子的严格调控。荧光假单胞菌2P24中，PcoI
‑
PcoR群体感应系统(quorum
‑
sensing system)是莫匹罗星产生所必需的。当细菌细胞浓度达到一定阈值时，PcoI合成的信号分子与转录调控因子PcoR相结合，从而激活PcoR。被活化的PcoR则结合到莫匹罗星合成基因簇启动子区域，促进莫匹罗星合成基因簇。因此缺失pcoI基因或pcoR基因可显著降低菌株2P24中莫匹罗星的产量。除PcoI
‑
PcoR群体感应系统外，转录调控因子MvaT和RsaL通过不同的信号通路调控莫匹罗星的产生。研究表明缺失mvaT基因或rsaL基因可显著提高菌株2P24中莫匹罗星的产量。此外，由核苷酸五磷酸鸟苷或和四磷酸鸟苷(p)ppGpp信号介导的细菌严紧反应途径也参与调控莫匹罗星的合成过程。
[0004]莫匹罗星的合成分为化学合成法和生物合成法。化学合成法需要多个化学反应步骤，生产过程中，需要消耗大量的化学药品和能源，且对环境不友好。因此生物合成法是目前广泛用于莫匹罗星生产的方法。但目前的制作方法存在发酵水平低下这一突出问题。基于此，急需通过分子生物学等技术手段提高工程菌株中莫匹罗星的产量，从而降低生产成本。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的在于提供一种高产莫匹罗星的荧光假单胞菌基因工程菌株及制作方法，该基因工程菌株可使莫匹罗星发酵产量达到15mg/mL，为降低莫匹罗星的生产成本提供了坚实基础。
[0006]第一方面，本专利技术所提供的高产莫匹罗星的荧光假单胞菌的工程菌株，具体是敲除荧光假单胞菌2P24基因组中的spoT基因、relA基因、mvaT基因和rsaL基因，从而得到荧光假单胞菌基因工程菌2P24ΔATTL。
[0007]第二方面，本专利技术提供一种高产莫匹罗星的荧光假单胞菌基因工程菌株的制作方法，以产莫匹罗星的荧光假单胞菌2P24为出发菌株，分别将菌株2P24基因组上具有负调控功能的spoT、relA、mvaT和rsaL基因进行敲除，从而得到高产莫匹罗星的荧光假单胞菌基因
工程菌株2P24ΔATTL。
[0008]进一步，spoT基因的敲除方法如下：
[0009]1)扩增spoT基因上下游片段，通过融合PCR法将spoT基因上下游片段连接并克隆到p2P24Km自杀质粒中得到spoT基因重组质粒p2P24
‑
spoT；
[0010]2)通过电击转化将p2P24
‑
spoT导入荧光假单胞菌2P24中；
[0011]3)通过蔗糖平板筛选、PCR筛选共同筛选得到工程菌株2P24ΔspoT；
[0012]进一步的，spoT基因的序列如SEQ ID NO.1所示；
[0013]扩增spoT基因上游片段的引物包括spoT
‑
F1和spoT
‑
R1，序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；
[0014]扩增spoT基因下游片段的引物包括spoT
‑
F2和spoT
‑
R2，序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；
[0015]采用融合PCR法获得spoT基因上下游融合片段序列如SEQ ID NO.6所示。
[0016]进一步，relA基因的敲除方法如下：
[0017]1)扩增relA基因上下游片段，通过融合PCR法将relA基因上下游片段连接并克隆到p2P24Km自杀质粒中得到relA基因重组质粒p2P24
‑
relA；
[0018]2)通过电击转化将p2P24
‑
relA导入工程菌株2P24ΔspoT；
[0019]3)通过蔗糖平板筛选、PCR筛选共同筛选得到工程菌株2P24ΔspoTΔrelA；
[0020]进一步的，relA基因的序列如SEQ ID NO.7所示；
[0021]扩增relA基因上游片段的引物包括relA
‑
F1和relA
‑
R1，序列分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；
[0022]扩增relA基因下游片段的引物包括relA
‑
F2和relA
‑
R2，序列分别如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示；
[0023]采用融合PCR法获得relA基因上下游融合片段序列如SEQ ID NO.12所示。
[0024]进一步，mvaT基因的敲除方法如下：
[0025]1)扩增mvaT基因上下游片段，通过融合PCR法将mvaT基因上下游片段连接并克隆到p2P24Km自杀质粒中得到mvaT基因重组质粒p2P24
‑
mvaT；
[0026]2)通过电击转化将p2P24
‑
mvaT导入工程菌株2P24ΔspoTΔrelA；
[0027]3)通过蔗糖平板筛选、PCR筛选共同筛选得到工程菌株2P24ΔspoTΔrelAΔmvaT；
[0028]进一步的，mvaT基因的序列如SEQ ID NO.13所示；
[0029]扩增mvaT基因上游片段的引物包括mvaT
‑
F1和mvaT
‑
R1，序列分别如SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15所示；
[0030]扩增mvaT基因下游片段的引物包括mvaT
‑
F2和mvaT
‑
R2，序列分别如SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17所示；
[0031]采用融合PCR法获得mvaT基因上下游融合片段序列如SEQ ID NO.18所示。
[0032]进一步，rsaL基因的敲除方法如下：
[0033]1)扩增r本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种高产莫匹罗星的荧光假单胞菌基因工程菌株，其特征在于，具体是敲除荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)2P24基因组中的spoT基因、relA基因、mvaT基因和rsaL基因，所得到的荧光假单胞菌基因工程菌株2P24ΔATTL。2.一种如权利要求1所述的高产莫匹罗星的荧光假单胞菌基因工程菌株的制作方法，其特征在于，以具有高产莫匹罗星的荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)2P24为出发菌株，利用基因重组技术分别敲除2P24基因组中的spoT基因、relA基因、mvaT基因和rsaL基因，得到高产莫匹罗星的荧光假单胞菌基因工程菌株2P24ΔATTL。3.如权利要求2所述的制作方法，其特征在于，spoT基因的具体敲除方式如下：1)扩增spoT基因上下游片段，通过融合PCR法将spoT基因上下游片段连接并克隆到p2P24Km自杀质粒中，得到spoT基因重组质粒p2P24
‑
spoT；2)通过电击转化将p2P24
‑
spoT导入荧光假单胞菌2P24中；3)通过蔗糖平板筛选、PCR筛选共同筛选得到工程菌株2P24ΔspoT。4.如权利要求3所述的制作方法，其特征在于，spoT基因的序列如SEQ ID NO.1所示；扩增spoT基因上游片段的引物包括spoT
‑
F1和spoT
‑
R1，序列分别如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示；扩增spoT基因下游片段的引物包括spoT
‑
F2和spoT
‑
R2，序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示；采用融合PCR法获得spoT基因上下游融合片段序列如SEQ ID NO.6所示。5.如权利要求2所述的制作方法，其特征在于，relA基因的具体敲除方式如下：1)扩增relA基因上下游片段，通过融合PCR法将relA基因上下游片段连接并克隆到p2P24Km自杀质粒中，得到relA基因重组质粒p2P24
‑
relA；2)通过电击转化将p2P24
‑
relA导入荧光假单胞菌2P24ΔspoT中；3)通过蔗糖平板筛选、PCR筛选共同筛选得到工程菌株2P24ΔspoTΔrelA。6.如权利要求5所述的制作方法，其特征在于，relA基因的序列如SEQ ID NO.7所示；扩增relA基因上游片段的引物包括relA
‑
F1和relA
‑
R1，序列分别如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示；扩增relA基...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴小刚，张博，尚睿婧，于小喻，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。