【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种降低了由亮氨酸引起的反馈抑制的修饰型α-异丙基苹果酸合酶、对所述修饰型α-异丙基苹果酸合酶进行编码的多核苷酸、导入了所述多核苷酸的基因修饰微生物、以及使用所述基因修饰微生物来生产规定的目标物质的方法。此外，本申请基于2021年3月29日向日本专利厅提交的日本专利申请no.特愿2021-054521而主张优先权，在本说明书中出于所有目的而引用所述日本专利申请的内容。此外，在本说明书中也出于所有目的而引用本申请中所提及的各现有技术文献的公开内容。
技术介绍
1、l-亮氨酸是必需的氨基酸的一种，是广泛用于医药、食品、饲料添加物、工业药品等中的高价的氨基酸，主要使用微生物来生产。具体而言，包含l-亮氨酸的支链氨基酸的发酵生产主要是利用埃希菌(escherichia)属微生物或棒状杆菌(corynebacterium)属微生物来进行。已知以丙酮酸为起点经过各种阶段而生物合成2-酮异己酸来作为前体。在此种l-亮氨酸生物合成路径中，α-异丙基苹果酸合酶(α-isopropyl malate synthase)(2-异丙基苹果酸合酶、α-异丙基苹果酸合酶(α-isopropyl malic acid synthase)、ec 2.3.3.13；以下，有时称为“ipms”)发挥主要作用，从各种生物种中分离对所述酶进行编码的基因，进而在大量的生物种中也确定了所述基因的核苷酸序列及酶类蛋白质的氨基酸序列。
2、且说，已知，在l-亮氨酸生物合成路径中，ipms发挥重要作用，但经常可产生其酶活性因所生成的最终产物即l-亮氨酸
3、例如，在专利文献1中，公开了一种通过对具有l-亮氨酸生产能力、且消除了由l-亮氨酸引起的抑制的α-异丙基苹果酸合酶进行编码的脱氧核糖核酸(deoxyribonucleicacid，dna)而经形质转换的微生物、以及使用所述微生物的l-亮氨酸的制造方法。在专利文献1记载的技术中，所谓“消除了由l-亮氨酸引起的抑制的α-异丙基苹果酸合酶”，是从具有l-亮氨酸生产能力的大肠埃希菌(e.coli)的变异株进行克隆而得的由变异型leua基因编码的变异型ipms，所述变异型ipms的特征在于相对于对应的野生型ipms而具有规定的氨基酸取代。在专利文献1中，实际上，通过利用若干个变异型ipms编码核酸对规定的大肠埃希菌菌株进行形质转换而获取l-亮氨酸生产株，关于所获得的各l-亮氨酸生产株，记载了对ipms的比活性及由l-亮氨酸引起的反馈抑制的程度以及l-亮氨酸的生产能力进行评价而得的结果。
4、进而，在专利文献2中，公开了一种相对于源自谷氨酸棒状杆菌(corynebacteriumglutamicum)的由leua基因编码的野生型ipms的氨基酸序列而使第553位的酪氨酸残基变异为天冬氨酸而得的变异型ipms、对所述变异型ipms进行编码的核苷酸、以及用于利用导入了所述核苷酸的微生物来制造l-亮氨酸或酮异己酸(ketoisocaproate，kic)的发酵法的技术，并提及了所述变异型ipms降低了由l-亮氨酸等引起的酶活性的反馈抑制。更详细而言，在专利文献2中，制作对谷氨酸棒状杆菌atcc13032株导入对所述变异型ipms进行编码的基因(变异型leua基因)而得的基因重组菌株，对于所述基因重组菌株，使用野生型atcc13032株作为对照并进行kic及l-亮氨酸的制造试验，结果，确认到：相对于野生型atcc13032株，所述基因重组菌株被赋予了这些物质的生产能力。
5、进而，在专利文献3中，也公开了一种相对于源自谷氨酸棒状杆菌的由leua基因编码的ipms而具有规定的氨基酸取代的变异型ipms、导入了对所述变异型ipms进行编码的核酸的谷氨酸棒状杆菌重组菌株、以及使用所述重组菌株的l-亮氨酸的制造方法。认为在专利文献3中记载有：关于所述变异型ipms所具有的氨基酸取代，在相同文献中作为基准的ipms的氨基酸序列中，是第494位的精氨酸被取代为组氨酸，第497位的甘氨酸被取代为天冬氨酸，且第499位的亮氨酸被取代为缬氨酸。但是，在谷氨酸棒状杆菌所具有的野生型ipms(leua基因蛋白质)的氨基酸序列中，第494位、第497位及第499位的各氨基酸与专利文献3中提及的取代前的各氨基酸不同，专利文献3是基于中文的文献，因此其公开内容有很多不清楚的点。
6、进而，在专利文献4中，公开了一种具有ipms活性的新颖变异型多肽、对所述变异型多肽进行编码的多核苷酸、包含所述多肽的微生物、以及对所述微生物进行培养而生产l-亮氨酸的方法。在专利文献4中，所谓“具有ipms活性的新颖变异型多肽”，更具体而言，被规定为在源自谷氨酸棒状杆菌的由leua基因编码的野生型ipms氨基酸序列中，第558位的精氨酸残基被取代为精氨酸以外的其他氨基酸残基或第561位的甘氨酸残基被取代为甘氨酸以外的其他氨基酸残基而得的具有ipms活性的变异型多肽。在专利文献4中，实际制作的ipms变异体及导入了所述ipms变异体的菌株为分别具有r558h、r558a、r558q、g561d、g561r、g561y的各氨基酸取代的ipms变异体、以及具有基于r55h及g561d的组合的氨基酸取代的ipms变异体、与分别导入了这些变异体的谷氨酸棒状杆菌重组菌株，并确认到这些重组菌株相对于野生株而言提高了l-亮氨酸的生产能力。
7、现有技术文献
8、专利文献
9、专利文献1：日本专利特开2001-37494号公报
10、专利文献2：日本专利特表2015-514431号公报
11、专利文献3：中国专利申请公开第104480058号公报
12、专利文献4：日本专利特表2020-503045号公报
技术实现思路
1、专利技术所要解决的问题
2、本专利技术的目的在于提供一种新颖ipms变异体，其可对各种微生物赋予包含l-亮氨酸或其前体的派生物的生产能力。
3、解决问题的技术手段
4、为了解决所述问题而反复进行了努力研究，结果，通过将对于针对l-亮氨酸的反馈抑制具有抗性的ipms的多种独立的变异适当组合，而观察到单独的变异中未获得的显著的l-亮氨酸生产性的增加，从而完成了本专利技术。
5、即，根据本专利技术的形态，提供以下内容。
6、[1]一种修饰型α-异丙基苹果酸合酶，包含由下述(a)～(c)的任一者规定的氨基酸序列，且与包含序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质相比，降低了l-亮氨酸反馈抑制：
7、(a)在序列号2所示的氨基酸序列中，具有选自下述(a)～(c)中的至少两种取代的氨基酸序列；
8、(b)相对于序列号2所示的氨基酸序列而具有60％以上的序列同一性，且包含选自下述(a)～(c)中的至少两种取代的氨基酸序列；
9、(c)在序列号2所示的氨本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种修饰型α-异丙基苹果酸合酶，包含由下述(A)～(C)的任一者规定的氨基酸序列，且与包含序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质相比，降低了L-亮氨酸反馈抑制：
2.根据权利要求1所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，其中所述(B)中规定的氨基酸序列是相对于序列号2所示的氨基酸序列而具有84％以上的序列同一性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，其中所述(B)中规定的氨基酸序列是相对于序列号2所示的氨基酸序列而具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，包含所述(a)～(c)中规定的所有取代。
5.根据权利要求4所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，包含由所述(A)或(C)规定的氨基酸序列。
6.一种修饰型α-异丙基苹果酸合酶，与对应的野生型2-异丙基苹果酸合酶相比，具有降低L-亮氨酸反馈抑制的至少一种氨基酸变异，
7.根据权利要求6所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，其中所述至少一种氨基酸变异包含所述(a')～(c')中规定
8.根据权利要求1至7中任一项所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，包含在源自棒状杆菌属细菌的野生型2-异丙基苹果酸合酶的氨基酸序列中具有所述至少两种取代的氨基酸序列。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，其中所述至少两种取代是选自下述(d)～(f)中的至少两种取代：
10.根据权利要求9所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，包含所述(d)～(f)中规定的所有取代。
11.根据权利要求10所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，包含由所述(A)或(C)规定的氨基酸序列。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，其中所述至少两种取代是选自下述(g)～(j)中的至少两种取代：
13.根据权利要求12所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，包含所述(g)～(j)中规定的所有取代。
14.根据权利要求13所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，包含由所述(A)或(C)规定的氨基酸序列。
15.一种多核苷酸，对如权利要求1至14中任一项所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶进行编码。
16.一种微生物，导入了如权利要求15所述的多核苷酸。
17.一种微生物，包含如权利要求1至14中任一项所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶。
18.根据权利要求16或17所述的微生物，为棒状型细菌。
19.根据权利要求18所述的微生物，为谷氨酸棒状杆菌。
20.根据权利要求16至19中任一项所述的微生物，其中野生型α-异丙基苹果酸合酶活性经降低或经灭活。
21.一种生产目标物质的方法，包括：
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述目标物质为(2S)-2-异丙基苹果酸酯、2-异丙基苹果酸酯、(2R,3S)-3-异丙基苹果酸酯、(2S)-2-异丙基-3-氧代琥珀酸酯、4-甲基-2-氧代戊酸酯或L-亮氨酸或在生物合成路径上经由这些化合物的代谢产物。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述目标物质为L-亮氨酸或由其衍生的代谢产物。
...【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
1.一种修饰型α-异丙基苹果酸合酶，包含由下述(a)～(c)的任一者规定的氨基酸序列，且与包含序列号2所示的氨基酸序列的蛋白质相比，降低了l-亮氨酸反馈抑制：
2.根据权利要求1所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，其中所述(b)中规定的氨基酸序列是相对于序列号2所示的氨基酸序列而具有84％以上的序列同一性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1或2所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，其中所述(b)中规定的氨基酸序列是相对于序列号2所示的氨基酸序列而具有90％以上的序列同一性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，包含所述(a)～(c)中规定的所有取代。
5.根据权利要求4所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，包含由所述(a)或(c)规定的氨基酸序列。
6.一种修饰型α-异丙基苹果酸合酶，与对应的野生型2-异丙基苹果酸合酶相比，具有降低l-亮氨酸反馈抑制的至少一种氨基酸变异，
7.根据权利要求6所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，其中所述至少一种氨基酸变异包含所述(a')～(c')中规定的所有取代。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，包含在源自棒状杆菌属细菌的野生型2-异丙基苹果酸合酶的氨基酸序列中具有所述至少两种取代的氨基酸序列。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，其中所述至少两种取代是选自下述(d)～(f)中的至少两种取代：
10.根据权利要求9所述的修饰型α-异丙基苹果酸合酶，包含所述(d)～(f)中规定的所有取...
【专利技术属性】
技术研发人员：中根修平，
申请(专利权)人：绿色地球研究所株式会社，
类型：发明
国别省市：
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