经过蓄积NADH的反应途径从起始物质制造目标物质的方法技术

一种经过蓄积NADH的反应途径从起始物质制造目标物质的方法，所述方法包括：在好氧条件下培养细菌；以及随后对所述细菌在所述起始物质与硝酸根离子的存在下、在厌氧条件下进行培养，从而生产所述目标物质。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】经过蓄积NADH的反应途径从起始物质制造目标物质的方法
本专利技术涉及一种经过蓄积NADH的反应途径从起始物质制造目标物质的方法。
技术介绍
目前，在好氧条件下进行细菌的增殖培养、随后在厌氧条件下进行物质生产的发酵技术主要使用棒状杆菌属菌来进行(乾M(InuiM)、村上S(MurakamiS)、冲野S(OkinoS)、川口H(KawaguchiH)、韦尔特A.A.(VertesA.A.)、汤川H(YukawaH)，分子微生物学与生物技术杂志(JournalofMolecularMicrobiologyandBiotechnology，JMolMicrobiolBiotechnol).2004；7(4)：182-196.)。所述发酵技术也使用大肠杆菌来进行(维穆里G.N.(VemuriG.N.)、艾特曼M.A.(EitemanM.A.)、阿特曼E.(AltmanE.)，应用及环境微生物学(AppliedandEnvironmentalMicrobiology，ApplEnvironMicrobiol).2002年4月(2002Apr)；68(4)：1715-1727.)。关于上述发酵技术，由于在好氧条件下细菌进行增殖，因此可制备高浓度的菌体，且由于在厌氧条件下实质上不发生细菌的增殖，因此可效率良好地进行物质生产，就上述方面而言优异。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种使用细菌、经过蓄积还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamideadeninedinucleotidereduced，NADH)的反应途径从起始物质效率良好地制造目标物质的方法。根据一个方面，提供一种经过蓄积NADH的反应途径从起始物质制造目标物质的方法，所述方法包括：在好氧条件下培养细菌；以及随后对所述细菌在所述起始物质与硝酸根离子的存在下、在厌氧条件下进行培养，从而生产所述目标物质。根据本专利技术，提供一种使用细菌、经过蓄积NADH的反应途径从起始物质效率良好地制造目标物质的方法。附图说明图1是表示棒状细菌生产丙酮酸或经由丙酮酸作为中间代谢物来进行生物合成的化合物的工艺的示意图。图2是表示大肠杆菌生产丙酮酸或经由丙酮酸作为中间代谢物来进行生物合成的化合物的工艺的示意图。具体实施方式以下对本专利技术进行详细说明，但以下的说明旨在详细地说明本专利技术，并未意图限定本专利技术。1.目标物质的制造方法关于当利用细菌的糖酵解体系在厌氧条件下从葡萄糖生产丙酮酸时妨碍丙酮酸的生产效率的原因，本专利技术者推测如下。在糖酵解体系的反应途径中从葡萄糖生产丙酮酸的期间，从1摩尔的葡萄糖生产2摩尔的NADH，但不存在消耗NADH的反应，因此NADH在菌体内蓄积。但是，在厌氧条件下的物质生产中，培养液中溶解氧的量少，无法利用氧将细菌所生产的NADH氧化。菌体内所蓄积的NADH阻碍生产NADH的酶(3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH))的活性，妨碍糖酵解体系的反应的顺利进行，其结果，防碍了丙酮酸的生产效率。本专利技术者基于上述推测，发现通过添加硝酸盐，与丙酮酸的生产一起进行利用硝酸呼吸消耗NADH的反应，结果可提高丙酮酸的生产效率。另外，关于经由丙酮酸作为中间代谢物来进行生物合成的化合物(以下，也称为丙酮酸衍生物)，本专利技术者也确认到：在从葡萄糖生产丙酮酸衍生物的反应途径中NADH在菌体内蓄积的情况下，通过硝酸盐的添加，利用硝酸呼吸消耗NADH，由此可提高丙酮酸衍生物的生产效率。上文所述的提高丙酮酸或丙酮酸衍生物的生产效率的效果是基于以下情况：通过硝酸盐的添加，利用硝酸呼吸消耗NADH，由此消除NADH在菌体内的蓄积。由此，可恢复因NADH的蓄积而受到阻碍的所有酶的活性。因此，本专利技术并不限于丙酮酸或丙酮酸衍生物的生产，可一般化为“经过蓄积NADH的反应途径从起始物质生产目标物质的任意情况”。即，根据经一般化的专利技术，提供一种经过蓄积NADH的反应途径从起始物质制造目标物质的方法，所述方法包括：在好氧条件下培养细菌；以及随后对所述细菌在所述起始物质与硝酸根离子的存在下、在厌氧条件下进行培养，从而生产所述目标物质。若依照所述方法而在起始物质与硝酸根离子的存在下、在厌氧条件下培养细菌，则细菌实质上不会增殖，因此可将起始物质效率良好地用于物质生产，并且与硝酸根离子的还原反应共轭地，通过氧化反应来消耗物质生产的过程中蓄积的NADH，可消除NADH在菌体内的蓄积。由此，可效率良好地生产目标物质。当细菌将硝酸根离子还原时，会生成亚硝酸根离子。已知亚硝酸根离子显示细胞毒性。因此，所述方法可还包括：使通过细菌将硝酸根离子还原而生成的亚硝酸根离子与过氧化氢反应，从而氧化为硝酸根离子。具体而言，“蓄积NADH的反应途径”为：包括伴有NADH产生的反应(即，NAD+向NADH的还原反应)、但不包括伴有NADH消耗的反应(即，NADH向NAD+的氧化反应)的反应途径；或者包括伴有NADH产生的反应以及伴有NADH消耗的反应，且在伴有NADH产生的反应中生产的NADH分子的总数比在伴有NADH消耗的反应中消耗的NADH分子的总数多的反应途径。此处，“NADH分子的总数”也可改称为“NADH分子的总摩尔数”。作为前者的反应途径，可列举用于从葡萄糖制造丙酮酸的反应途径。用于从葡萄糖制造丙酮酸的反应途径包括伴有NADH产生的反应，但不包括伴有NADH消耗的反应，在使用了1分子的葡萄糖的情况下，生产出2分子的NADH。作为后者的反应途径，可列举用于从葡萄糖经过乙酰辅酶A(CoA)制造乙醛的反应途径。用于从葡萄糖经过乙酰CoA制造乙醛的反应途径包括伴有NADH产生的反应以及伴有NADH消耗的反应，在使用了1分子的葡萄糖的情况下，生产出4分子的NADH，并消耗2分子的NADH。关于起始物质及目标物质的组合，只要从起始物质至目标物质的反应途径为“蓄积NADH的反应途径”，则并无特别限制。起始物质及目标物质的组合可列举：起始物质为葡萄糖、目标物质为丙酮酸的情况；起始物质为葡萄糖、目标物质为乙酸的情况；起始物质为葡萄糖、目标物质为草酰乙酸的情况；起始物质为乙醇、目标物质为乙醛的情况；起始物质为乳酸、目标物质为丙酮酸的情况；起始物质为木糖、目标物质为丝氨酸的情况；起始物质为琥珀酸、目标物质为苹果酸的情况等。所述方法利用的是在好氧条件下进行细菌的增殖培养、随后在厌氧条件下进行物质生产的现有的发酵技术。因此，所述方法除了在硝酸根离子的存在下进行厌氧条件下的物质生产以外，可利用现有的发酵技术来实施。若利用现有的发酵技术，则可根据所欲制造的目标物质的种类，适当设定所使用的细菌的种类、增殖培养的条件、用于物质生产的培养的条件等。为了实施所述方法，必要时也可参照后述的“2.丙酮酸或丙酮酸衍生物的制造方法”一栏的记载。在所述方法中，“硝酸根离子”可以硝酸盐的形式添加至培养液中。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种经过蓄积还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的反应途径从起始物质制造目标物质的方法，所述方法包括：/n在好氧条件下培养细菌；以及/n随后对所述细菌在所述起始物质与硝酸根离子的存在下、在厌氧条件下进行培养，从而生产所述目标物质。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种经过蓄积还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的反应途径从起始物质制造目标物质的方法，所述方法包括：
在好氧条件下培养细菌；以及
随后对所述细菌在所述起始物质与硝酸根离子的存在下、在厌氧条件下进行培养，从而生产所述目标物质。


2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述细菌欠缺选自由对乳酸脱氢酶进行编码的基因、对磷酸烯醇丙酮酸羧化酶进行编码的基因、对丙酮酸氧化酶进行编码的基因及对丙酮酸甲酸裂解酶进行编码的基因所组成的群组中的一个以上的基因的功能。


3.根据权利要求1或2所述的方法，还包括：使通过所述细菌将所述硝酸根离子还原而生成的亚硝酸根离子与过氧化氢反应，从而氧化为硝酸根离子。


4.一种方法，经过蓄积还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的反应途径，从糖类制造丙酮酸或经由丙酮酸作为中间代谢物来进行生物合成的化合物，所述方法包括：
在好氧条件下培养细菌；以及
随后对所述细菌在糖类与硝酸根离子的存在下、在厌氧条件下进行培养，从而生产丙酮酸或经由丙酮酸作为中间代谢物来进行生物合成的化合物。


5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述细菌欠缺选自由对乳酸脱氢酶进行编码的基因、对磷酸烯醇丙酮酸羧化酶进行编码的基因、对丙酮酸氧化酶进行编码的基因及对丙酮酸甲酸裂解酶进行编码的基因所组成的群组中的一个以上的基因的功能。


6.一种方法，经过蓄积还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的反应途径，从糖类制造丙酮酸或经由丙酮酸作为中间代谢物来进行生物合成的化合物，所述方法包括：
在糖类与硝酸根离子的存在下、在厌氧条件下，培养欠缺选自由对乳酸脱氢酶进行编码的基因、对磷酸烯醇丙酮酸羧化酶进行编码的基因、对丙酮酸氧化酶进行编码的基因及对丙酮酸甲酸裂解酶进行编...

【专利技术属性】
技术研发人员：中屋敷彻，
申请(专利权)人：绿色地球研究所株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP