转基因微生物及使用其的目标物质的生产方法技术

本公开涉及一种满足规定条件中的若干条件的转基因微生物。所述规定条件包括：(I)与野生型微生物相比，琥珀酸脱氢酶活性或富马酸还原酶活性经降低或失活；(II)与野生型微生物相比，乳酸脱氢酶活性经降低或失活；(III)具有修饰型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性或外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性，所述修饰型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性相对于野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性中的由天冬氨酸引起的反馈抑制而显示出抵抗性，所述外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性与野生型微生物显示出的野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性相比，相对于由天冬氨酸引起的反馈抑制的抵抗性更高；以及(IV)与野生型微生物相比，丙酮酸：醌氧化还原酶经降低或失活。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】转基因微生物及使用其的目标物质的生产方法
本专利技术涉及一种转基因微生物、以及使用其的物质的生产方法，所述转基因微生物的乳酸脱氢酶活性、琥珀酸脱氢酶活性或富马酸还原酶活性等规定的酶活性经降低或失活，且具有相对于由天冬氨酸引起的反馈抑制而显示出抵抗性的修饰型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性。此外，本申请基于2019年4月12日在日本专利厅提交的日本专利申请No.JP2019-76629(日本专利特愿2019-76629)而主张优先权，所述日本专利申请的内容出于所有目的而援用于本说明书中。
技术介绍
在使用微生物的物质生产技术中，进行了如下的提高多种目标物质的生产效率的尝试：在参与由植物来源的糖产生目标物质的过程的代谢体系中，利用转基因技术等来强化代谢酶的活性，或者使一部分代谢酶的活性失活等。例如，关于很多氨基酸，利用此种技术且使用微生物的生产正在以商用水平进行。另一方面，也存在由石油来源的原料制作的氨基酸。例如，在广泛用于医疗品、食品添加剂、人工甜味剂等中利用的天冬苯丙二肽酯(aspartame)及作为生物降解性树脂的聚天冬胺酸的原料等中的天冬胺酸的工业生产中，使用由石油大量且廉价地合成的富马酸作为原料。更详细而言，采用的是如下方法：在如上所述由石油合成的富马酸中加入氨，使微生物所产生的天冬氨酸酶作用于此，由此合成天冬氨酸。现在，一般而言利用k-卡拉胶将具有高天冬酶活性的大肠杆菌固定化来进行连续酶反应。但现状是，在1973年旧田边制药股份有限公司确立了此手法之后，在此领域中一直未发生大的技术革新。而且，现状是，关于利用包括微生物发酵的生物工程学手法而能够从作为比富马酸廉价的碳源的葡萄糖生产天冬氨酸的技术开发的报告，数量少。若强行举例，则其大部分仅限于涉及使用天冬氨酸脱氢酶的手法的报告。例如，在专利文献1中，记载了一种变异型天冬氨酸脱氢酶及使用其的L-天冬氨酸制造方法，通过对枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)来源的天冬氨酸脱氢酶导入变异而提高了酶活性。专利文献1中记载的L-天冬氨酸制造方法实际上采用的是以下手法：对大肠杆菌中表达出的所述变异型天冬氨酸脱氢酶进行精制，并使用精制后的变异型酶在体外(invitro)酶反应体系中生成天冬氨酸。因此，专利文献1中记载的方法严格来说不能称为天冬氨酸的发酵生产技术。进而，对更适合于发酵生产的天冬氨酸脱氢酶也在进行探索，例如，在专利文献2中，发现了一种即便在常温下也发挥高催化剂活性的、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)PA01株或富养罗尔斯通氏菌(Ralstoniaeutropha)JM134株来源的天冬氨酸脱氢酶，并公开了一种使用所述天冬氨酸脱氢酶的L-天冬氨酸制造方法。更详细而言，在专利文献2中记载了：通过对表达所述规定的天冬氨酸脱氢酶的大肠杆菌进行甲苯处理而制备酶混合物，使用所述酶混合物并利用体外酶法制造天冬氨酸；以及使用导入有所述规定的天冬氨酸脱氢酶的大肠杆菌，通过以琥珀酸为基质的培养发酵来生产天冬氨酸。在专利文献2中，记载了在所述培养发酵中即便使用柠檬酸或葡萄糖来代替作为基质的琥珀酸，也确认到天冬氨酸的生成，但并未示出从这些基质向天冬氨酸的转换效率或反应速度等任何具体的数据，关于专利文献2中公开的技术是否能够称为适合于天冬氨酸的工业生产的技术，有诸多疑问。此外，在专利文献2的
技术介绍
一项中，记载了若使用专利文献3中公开的古细菌闪烁古生球菌(Archaeoglobusfulgidus)来源的天冬氨酸脱氢酶，则能够获得天冬氨酸，但在专利文献2及专利文献3的任一者中，均未记载使用所述闪烁古生球菌来源的天冬氨酸脱氢酶实际制造出了天冬氨酸。进而，在专利文献4中，公开了一种肠内细菌科细菌、及使用所述细菌制造L-天冬氨酸或由所述L-天冬氨酸衍生的代谢产物的方法，通过导入天冬氨酸脱氢酶来生产L-天冬氨酸或由所述L-天冬氨酸衍生的代谢产物。具体而言，专利文献4中公开的细菌是通过在大肠埃希菌(Escherichiacoli)(大肠杆菌)等中导入来源于海栖热袍菌(Thermotogamaritima)或谷氨酸棒状杆菌(Corynebacteriumglutamicum)等的各种异种性天冬氨酸脱氢酶基因而获得的重组体。在专利文献4中示出了：根据通过此种异种性天冬氨酸脱氢酶基因的导入而赋予了所述酶活性的大肠杆菌，L-天冬氨酸及其下游的代谢产物可得到一定程度的增加。现有技术文献专利文献专利文献1：日本专利特开2006-254795号公报专利文献2：日本专利特开2010-183860公报专利文献3：日本专利特开2006-254730号公报专利文献4：日本专利特表2013-516958公报专利文献5：日本专利特开2007-43947公报专利文献6：日本专利特开平8-70860公报专利文献7：日本专利特表2003-503064公报非专利文献非专利文献1：利萨诺夫B、卡布斯A、布罗克M、博特M(LitsanovB、KabusA、BrockerM、BottM).微生物生物技术(MicrobialBiotechnology，MicrobBiotechnol).2012年1月(2012Jan)；5(1)：116-28.非专利文献2：陈振、布玛莱迪RR、弗兰克D、拉佩特S、曾AP(ChenZ，BommareddyRR，FrankD，RappertS，ZengAP).应用与环境微生物学(AppliedandEnvironmentalMicrobiology，ApplEnvironMicrobiol).2014年2月(2014Feb)；80(4)：1388-93.非专利文献3：和田M、泽田K、小仓K、下野Y、萩原T、杉本M、小贯A、横田A(WadaM、SawadaK、OguraK、ShimonoY、HagiwaraT、SugimotoM、OnukiA、YokotaA).生物科学与生物工程杂志(JournalofBioscienceandBioengineering，JBiosciBioeng).2016年2月(2016Feb)；121(2)：172-7.非专利文献4：矢野M1、泉井K(YanoM1，IzuiK).欧洲生物化学杂志(EuropeanJournalofBiochemistry，EurJBiochem).1997年7月1日(1997Jul1)；247(1)：74-81.
技术实现思路
专利技术所要解决的问题如上所述，天冬氨酸被广泛用作作为医疗品、食品添加剂、人工甜味剂而利用的天冬苯丙二肽酯、及作为生物降解性树脂的聚天冬胺酸的原料等。除此之外，天冬氨酸在微生物中例如作为β丙氨酸、天冬酰胺等进一步的代谢物的中间物质而具有重要的作用，在由天冬氨酸派生的所述代谢物的发酵生产技术的开发中，可以说也重要的是强化至天冬氨酸为止的代谢体系。然而，现状是，现在的天冬氨酸的工业生产是将由石油大量且廉价地合成的富马酸作为原料，利用以生物质(bi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种转基因微生物，满足所有下述条件(I)～条件(III)：/n条件(I)与所述转基因微生物的对应野生型微生物相比，琥珀酸脱氢酶活性或富马酸还原酶活性经降低或失活；/n条件(II)与所述野生型微生物相比，乳酸脱氢酶活性经降低或失活；/n条件(III)具有修饰型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性或外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性，所述修饰型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性相对于野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性中的由天冬氨酸引起的反馈抑制而显示出抵抗性，所述外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性与所述野生型微生物显示出的野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性相比，相对于由天冬氨酸引起的反馈抑制的抵抗性更高。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20190412 JP 2019-0766291.一种转基因微生物，满足所有下述条件(I)～条件(III)：
条件(I)与所述转基因微生物的对应野生型微生物相比，琥珀酸脱氢酶活性或富马酸还原酶活性经降低或失活；
条件(II)与所述野生型微生物相比，乳酸脱氢酶活性经降低或失活；
条件(III)具有修饰型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性或外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性，所述修饰型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性相对于野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性中的由天冬氨酸引起的反馈抑制而显示出抵抗性，所述外源性磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性与所述野生型微生物显示出的野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性相比，相对于由天冬氨酸引起的反馈抑制的抵抗性更高。


2.根据权利要求1所述的转基因微生物，还满足条件(IV)：与所述野生型微生物相比，丙酮酸：醌氧化还原酶经降低或失活。


3.一种生产目标物质的方法，包括：
(p)使用如权利要求1或2所述的转基因微生物的菌体或其菌体处理物生成目标物质；以及
(q)回收所述目标物质。


4.根据权利要求3所述的方法，其中，在工序(p)中，通过在所述转基因微生物实质上不增殖的还原条件下的反应介质(X)中，使所述转基因微生物的菌体或其菌体处理物反应来生成目标物质。


5.根据权利要求4所述的方法，其中，所述反应介质(X)的氧化还原电位是处于-200毫伏至-500毫伏的范围内的规定值。


6.根据权利要求4或5所述的方法，其中，所述反应介质(X)包含糖类。


7.根据权利要求4至6中任一项所述的方法，其中，所述反应介质(X)包含葡萄糖。


8.根据权利要求3至7中任一项所述的方法，其中，在工序(p)之前，还包括：
(p')在规定的培养基(Y)中，在好氧条件下对所述转基因微生物预先进行培养及增殖，
并将在工序(p')中增殖的所述转基因微生物的菌体或其菌体处理物供于工序(p)中。


9.根据权利要求3至8中任一项所述的方法，其中，所述目标物质为草酰乙酸、苹果酸或在生物合成途径上经由这些化合物的代谢产物。


10.根据权利要求3至9中任一项所述的方法，其中，所述目标物质为天冬氨酸或由所述天冬氨酸衍生的代谢产物。


11.根据权利要求3至10中任一项所述的方法，其中，所述目标物质为天冬氨酸、β丙氨酸或天冬酰胺。


12.一种变异型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，相对于属于棒状细菌的微生物所保有的野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列，具有能够降低所述野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶活性中的由天冬氨酸引起的反馈抑制的氨基酸变异，
所述氨基酸变异以序列号2所示的氨基酸序列为基准，且至少包括：
(g)相当于第299位的天冬氨酸的氨基酸向天冬酰胺的氨基酸置换；以及
(i)相当于第813位的赖氨酸的氨基酸向规定的氨基酸的氨基酸置换其中，设为置换后的氨基酸不为赖氨酸)；或
(l)相当于第917位的天冬酰胺的氨基酸向规定的氨基酸的氨基酸置换(其中，设为置换后的氨基酸不为天冬酰胺)，
与相对于所述野生型磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列而仅具有所...

【专利技术属性】
技术研发人员：中屋敷彻，
申请(专利权)人：绿色地球研究所株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP