一种生产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，具体涉及一种生产羟基四氢嘧啶基因工程菌的构建及其应用。本发明专利技术在基因组上对羟基四氢嘧啶合成途径中的关键基因进行强化，并减弱羟基四氢嘧啶竞争抑制途径，构建羟基四氢嘧啶合成途径，并过表达异柠檬酸脱氢酶编码基因icd以增加前体物α‑酮戊二酸的供应，同时通过esaI/esaR群体感应线路策略对前体物质α‑酮戊二酸的供应进行动态调控，根据细胞密度自动调节α‑酮戊二酸在三羧酸循环中的代谢，得到一株羟基四氢嘧啶高产菌。所构建菌株可以在不添加α‑酮戊二酸的发酵条件下，实现羟基四氢嘧啶的高效合成，且无副产物四氢嘧啶的积累，具有重要的工业应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种生产羟基四氢嘧啶的基因工程菌及其应用
：本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种生产羟基四氢嘧啶基因工程菌的构建及其应用。
技术介绍
：羟基四氢嘧啶((4S,5S)-5-hydroxy-2-methyl-1,4,5,6-tetrahydropyrimidine-4-carboxylicacid)是四氢嘧啶的羟基化衍生物，被认为是最广泛分布的相容性溶质之一。由于其特殊的生物学特性，使其有别于其他相容性溶质，如其对提高蛋白质和细胞的耐热性的适用性，使之成为经济利益的目标。羟基四氢嘧啶被用于稳定大分子和整个细胞，稳定体外酶活性，促进体内蛋白质折叠，保护分子和细胞对冻融循环，促进抵抗干燥，氧化和温度应力保护剂。此外，羟基四氢嘧啶还是一种优良的干燥保护剂，具有良好的玻璃化性能。另外，羟基四氢嘧啶稳定基因治疗的逆转录病毒载体，允许逆转录病毒载体的长期储存，是有潜力的基因治疗工具。羟基四氢嘧啶增强抵抗细胞和DNA对电离辐射和紫外线引起的损害，并防止UV诱导的皮肤细胞损伤，这些特性促进了羟基四氢嘧啶在护肤产品的广泛发展。目前，羟基四氢嘧啶的生产方法主要通过“细菌挤奶”工艺实现，即在高盐浓度下培养伸长嗜盐菌Halomonaselongata，通过不断地提高、降低发酵液的盐浓度，实现羟基四氢嘧啶在高盐浓度下的大量合成，以及低盐浓度下的迅速释放。该工艺设备要求高，能耗高，此外，高盐环境不利于菌体生长，导致生产周期长，目标产物合成效率低，且产物通常是羟基四氢嘧啶与四氢嘧啶的混合物，需要进一步采用色谱分离技术进行产品纯化。因此，羟基四氢嘧啶的产量低、成本高、市场价格十分昂贵。高副产物含量、高成本、低收率的问题严重制约了羟基四氢嘧啶的工业生产与应用，构建高效合成单一产物的基因工程菌株具有十分迫切的需求。为了获得羟基四氢嘧啶的高效生产菌株，本专利以大肠杆菌W3110为细胞底盘，通过理性设计构建羟基四氢嘧啶的高效合成途径。同时，针对羟基四氢嘧啶合成中存在的α-酮戊二酸供应不足、TCA循环与产物合成不协调等问题，本专利利用esaI/esaR群体感应系统构建出一株基于细胞密度自动进行羟基四氢嘧啶合成动态调控的大肠杆菌基因工程菌。所构建菌株可以在不添加α-酮戊二酸的发酵条件下，实现羟基四氢嘧啶的高效合成，且无副产物四氢嘧啶的积累，具有重要的工业应用价值。
技术实现思路
：针对上述存在问题，本专利技术目的是提供一种生产羟基四氢嘧啶的基因工程菌，及其构建与应用，并制定了相应的发酵过程控制方案，有良好的工业应用前景。本专利技术技术方案概述如下：本专利技术提供了一株生产羟基四氢嘧啶的大肠杆菌基因工程菌，在宿主基因组上整合具有木糖诱导型启动子PxylF控制的T7噬菌体的RNA聚合酶；整合单拷贝由PT7启动子控制的伸长盐单胞菌的四氢嘧啶合成酶基因簇ectABC；单拷贝由PT7启动子控制的来自谷氨酸棒杆菌的天冬氨酸激酶突变体基因lysCcgl(G1A,C932T)；双拷贝由PT7启动子控制的来自伸长盐单胞菌的四氢嘧啶羟化酶基因ectD；敲除羟基四氢嘧啶竞争支路代谢相关基因thrA；替换磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc启动子为Ptrc启动子以增加草酰乙酸的供应；引入文献报道的糖代谢转录抑制因子突变mlc*替换原有mlc解除葡萄糖抑制作用，构建羟基四氢嘧啶合成通路；增加异柠檬酸脱氢酶编码基因icd的拷贝数以增加羟基四氢嘧啶所需前体物α-酮戊二酸的供应；整合来自BioFAB库的组成型启动子PBIOFAB启动子控制的转录调节子esaR170V，将α-酮戊二酸分解代谢途径的关键基因α-酮戊二酸脱氢酶基因sucA的原始启动子替换为PesaS启动子，整合合适强度的启动子控制信号分子酰基高丝氨酸内酯合酶基因esaI，进一步增加前体物质α-酮戊二酸的积累。优选地，控制easI基因的启动子为Pbs1、Pbs2、Pbs3或Pbs4启动子；更优选地，控制easI基因的启动子为Pbs3启动子；所述编码基因Pbs3启动子的核苷酸序列为序列表SEQIDNO.12所示；所述T7RNA聚合酶基因，核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示；所述糖代谢转录抑制因子突变mlc*，核苷酸序列如序列表SEQIDNO.2所示；所述四氢嘧啶合成酶基因簇ectABC源自伸长盐单胞菌(Halomonaselongata)DSM2581，核苷酸序列如序列表SEQIDNO.3所示；所述天冬氨酸激酶突变体基因lysCcgl，核苷酸序列如序列表SEQIDNO.4所示；所述四氢嘧啶羟化酶基因ectD源自伸长盐单胞菌(H.elongata)DSM2581，核苷酸序列如序列表SEQIDNO.5所示；所述异柠檬酸脱氢酶编码基因icd源自大肠杆菌(E.coli)W3110，核苷酸序列如序列表SEQIDNO.6所示；所述编码基因PBIOFAB启动子的核苷酸序列为序列表SEQIDNO.7所示；所述转录调节子esaR170V源自斯图瓦提泛菌(Pantoeastewartia)DC283，核苷酸序列如序列表SEQIDNO.8所示；所述编码基因PesaS启动子源自斯图瓦提泛菌(P.stewartia)DC283，核苷酸序列如序列表SEQIDNO.9所示；所述编码基因Pbs1启动子的核苷酸序列为序列表SEQIDNO.10所示；所述编码基因Pbs2启动子的核苷酸序列为序列表SEQIDNO.11所示；所述编码基因Pbs4启动子的核苷酸序列为序列表SEQIDNO.13所示；所述酰基高丝氨酸内酯合酶基因esaI源自斯图瓦提泛菌(P.stewartia)DC283，核苷酸序列如序列表SEQIDNO.14所示。优选地，所述基因工程菌以大肠杆菌E.coliW3110为出发菌株。本专利技术还提供上述生产羟基四氢嘧啶的基因工程菌的构建方法，具体如下：本专利技术中采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对E.coliW3110进行定向改造，具体包括如下步骤：(1)在lacIZ基因位点上整合由木糖启动子PxylF控制的T7RNA聚合酶(核苷酸序列为序列表SEQIDNO.1)。(2)构建羟基四氢嘧啶合成通路。首先敲除天冬氨酸激酶基因thrA(GeneID:945803)减弱羟基四氢嘧啶竞争抑制，替换磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc(GeneID:948457)启动子为Ptrc启动子以增加天冬氨酸前体物草酰乙酸的供应，引入文献(NakashimaN,TamuraT.AnewcarboncataboliterepressionmutationofEscherichiacoli,mlc*,anditsuseforproducingisobutanol.JournalofBioscience&Bioengineering,2012,114(1):38-44.)报道的糖代谢转录抑制因子突变mlc*(核苷酸序列为序列表SEQIDNO.2)替换原有mlc解除葡萄糖抑制作用。同时在假基因位点本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株生产羟基四氢嘧啶的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，是在宿主基因组上整合具有木糖诱导型启动子P

【技术特征摘要】
1.一株生产羟基四氢嘧啶的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，是在宿主基因组上整合具有木糖诱导型启动子PxylF控制的T7噬菌体的RNA聚合酶；整合单拷贝由PT7启动子控制的四氢嘧啶合成酶基因簇ectABC；单拷贝由PT7启动子控制的天冬氨酸激酶基因lysCcgl；双拷贝由PT7启动子控制的四氢嘧啶羟化酶基因ectD；敲除羟基四氢嘧啶竞争支路代谢相关基因thrA；替换磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶编码基因ppc启动子为Ptrc启动子；糖代谢转录抑制因子突变体mlc*替换原有mlc；整合单拷贝异柠檬酸脱氢酶编码基因icd；整合PBIOFAB启动子控制的转录调节子esaR170V；将α-酮戊二酸脱氢酶基因sucA的原始启动子替换为PesaS启动子；整合信号分子酰基高丝氨酸内酯合酶基因esaI获得的。


2.如权利要求1所述的一株生产羟基四氢嘧啶的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于，easI基因的启动子为Pbs1、Pbs2、Pbs3或Pbs4启动子。


3.如权利要求1或2所述的一株生产羟基四氢嘧啶的大肠杆菌基因工程菌，其特征在于：
所述T7RNA聚合酶基因，核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1所示；
所述糖代谢转录抑制因子突变mlc*，核苷酸序列如序列表SEQIDNO.2所示；
所述四氢嘧啶合成酶基因簇ectABC，核苷酸序列如序列表SEQIDNO.3所示；
所述天冬氨酸激酶基因lysCcgl，核苷酸序列如序列表SEQIDNO.4所示；
所述四氢嘧啶羟化酶基因ectD，核苷酸序列如序列表SEQIDNO.5所示；
所述异柠檬酸脱氢酶编码基因icd，核苷酸序列如序列表SEQIDNO.6所示；
所述PBIOFAB启动子，核苷酸序列如序列表SEQIDNO.7所示；
所述转录调节子esaR...

【专利技术属性】
技术研发人员：马倩，夏利，谢希贤，陈宁，谭淼，孙全伟，张颖，杨蒙雅，徐庆阳，张成林，李燕军，范晓光，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：天津;12