本发明专利技术公开了一种利用简单脱毒的玉米芯纤维素水解液发酵生产BT的方法，属于发酵技术领域以及生物技术领域。本发明专利技术提供了一种可提高产BT大肠杆菌糠醛耐受的方法，此方法为：在产BT的重组大肠杆菌PKX00中分别过表达糠醛耐受基因，在含有0.4g/L糠醛的发酵培养基中进行培养；过表达ucpA基因的PKX01菌株表现出最好的糠醛耐受性能，生物量比PKX00提高了59％，使单位生物量BT产量提高了31％，在0.4g/L糠醛存在时BT产量最高为14.4g/L。在5L发酵罐中，糠醛耐受菌株PKX01利用玉米芯纤维素水解液发酵使得BT产量达到18.2g/L。得BT产量达到18.2g/L。得BT产量达到18.2g/L。
【技术实现步骤摘要】
一种利用简单脱毒的玉米芯纤维素水解液发酵生产BT的方法
[0001]本专利技术涉及一种利用简单脱毒的玉米芯纤维素水解液发酵生产BT的方法，属于发酵
以及生物
技术介绍
[0002]1,2,4
‑
丁三醇(BT)是一种无色、无味、非天然化合物。它是用于推进剂和炸药的1,2,4
‑
丁三醇三硝酸酯的前体，也是合成许多药物和其他有用化学品的主要成分。利用玉米芯纤维素水解液中的木糖来生产BT是一种降低成本的有效措施。
[0003]纤维素和半纤维素是自然界中丰富的可再生资源。他们的水解物中存在一些抑制剂，如糠醛，严重影响细胞的生长和发酵。糠醛会抑制大肠杆菌生长并延长滞后期，从而影响BT的合成。
[0004]大肠杆菌为了解决糠醛的抑制，需要依靠自身的NADPH氧化还原酶将糠醛还原为糠醇。大肠杆菌具有几种天然的糠醛耐受基因，如醛氧化还原酶YqhD,UcpA和FucO，对NADPH具有低Km的YqhD是大肠杆菌还原糠醛的主要力量。GroEL
‑
ES全局调控蛋白是一种众所周知的应激相关蛋白，也被成功应用于提高大肠杆菌的糠醛耐受性。增加细胞内NAD(P)H库也能有效去除糠醛毒性。LpcA增加了PPP途径中NADPH的形成。烟酸(NAD)补救途径合成酶pncB、nadD和nadE基因的过表达也增加了大肠杆菌中NAD(P)H文库。
[0005]玉米芯纤维素水解液目前主要的脱毒方法包括离子色谱法、Ca(OH)2法、Ca(OH)2+活性炭法，其中离子色谱法耗时、增加成本且污染环境，Ca(OH)2+活性炭法对糖的损失较为严重，Ca(OH)2法是最简单且糖损失较少的方法，但是存在抑制因子去除效果较差的缺点。
[0006]本专利技术将这些基因过表达用于提高大肠杆菌对糠醛的耐受性以生产BT，重组菌株利用简单脱毒的玉米芯纤维素水解液发酵生产BT。为纤维素水解生产高附加值化学品提供了信息。
技术实现思路
[0007]本专利技术提供了一种利用玉米芯纤维素水解液进行一步法发酵合成1,2,4
‑
丁三醇(BT)的方法，通过对工程菌株PKX00糠醛耐受性能的改造，实现产1,2,4
‑
丁三醇的工程菌株利用玉米芯纤维素水解液一步法发酵获得的BT产量得到显著提高。本专利技术首先提供了一种提高产1,2,4
‑
丁三醇大肠杆菌的糠醛耐受性能的方法，所述方法包括通过PCR克隆获得糠醛耐受基因，通过含有糠醛耐受基因质粒的表达，大肠杆菌对糠醛的耐受性能得到提高。
[0008]本专利技术提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌为，将大肠杆菌基因组上的木糖异构酶基因xylA、木糖激酶基因xylB、2
‑
脱氢
‑3‑
脱氧葡萄糖酸醛缩酶基因yagE、2
‑
脱氢
‑3‑
脱氧
‑
D
‑
戊酸醛缩酶基因yjhH、磷酸载体蛋白HPr PtsH基因ptsH、PTS酶I基因PtsI I及葡萄糖特异性PTS酶IIBC成分基因ptsG敲除；同时，过表达了来源于乳酸乳球菌的2
‑
酮酸脱羧酶KivD、来源于新月柄杆菌的木糖脱氢酶Xdh和糠醛耐受基因；所述糠醛耐受基因为来源于大肠杆菌的氧化还原酶ucpA、来源于大肠杆菌的氧化还原酶fucO、来源于大肠杆菌的全局调
控因子groES和groEL或来源于大肠杆菌的烟酸磷酸核糖转移酶pncB。
[0009]在本专利技术的一种实施方式中，所述木糖异构酶XylA基因的Gene ID为：948141；所述木糖激酶XylB基因的Gene ID为：948133；所述2
‑
脱氢
‑3‑
脱氧葡萄糖酸醛缩酶YagE基因的Gene ID为：944925；2
‑
脱氢
‑3‑
脱氧
‑
D
‑
戊酸醛缩酶YjhH基因的Gene ID为：948825；磷酸载体蛋白HPr PtsH基因的Gene ID为：946886；PTS酶I PtsI基因的Gene ID为：946879；葡萄糖特异性PTS酶IIBC成分PtsG基因的Gene ID为：945651；2
‑
酮酸脱羧酶KivD基因的Gene ID为：AJ746364；木糖脱氢酶Xdh基因的序列如SEQ ID NO.11所示；
[0010]在本专利技术的一种实施方式中，所述氧化还原酶ucpA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述氧化还原酶fucO的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述伴侣蛋白groES的氨基酸序列如SEQ ID NO.3，所述伴侣蛋白groEL的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述烟酸磷酸核糖转移酶pncB的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0011]在本专利技术的一种实施方式中，编码所述氧化还原酶ucpA的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，编码所述氧化还原酶fucO的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，编码述伴侣蛋白groES的核苷酸序列如SEQ ID NO.8，编码所述伴侣蛋白groEL的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，编码所述烟酸磷酸核糖转移酶pncB的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
[0012]在本专利技术的一种实施方式中，所述基因工程菌是采用pEtac为表达载体，过表达了来源于乳酸乳球菌的2
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酮酸脱羧酶KivD和来源于新月柄杆菌的木糖脱氢酶Xdh；同时采用pRSFDuet为表达载体，过表达了权利要求1所述的糠醛耐受基因。
[0013]本专利技术还提供了一种利用简单脱毒的玉米芯水解液发酵生产1,2,4
‑
丁三醇的方法，所述方法为，将上述基因工程菌添加至含有简单脱毒的玉米芯水解液的反应体系中，发酵生产1,2,4
‑
丁三醇。
[0014]在本专利技术的一种实施方式中，所述简单脱毒的玉米芯水解液的制备方法为：将60目的玉米芯粉末与1％ H2SO4按照1:10的固液体进行混合，并在121℃处理1h。过滤之后利用Ca(OH)2调节pH至11.0，过滤除去沉淀后在50℃进行蒸发浓缩，直至木糖浓度达到300g/L，并在100℃灭菌20min。
[0015]在本专利技术的一种实施方式中，所述反应体系为摇瓶发酵时，反应条件为，温度35
‑
38℃，转速200
‑
250rmp，发酵48～54h。
[0016]在本专利技术的一种实施方式中，所述反应体系为摇瓶发酵时，反应条件为：37℃，200r/min。
[0017]在本专利技术的一种实施方式中，所述反应体系为发酵罐发酵时，反应条件为，温度35
‑
38℃，转速350
‑
400rmp，发酵48～54h。
[0018]本专利技术还提供了上述基因工程菌在制备1,2,4
‑
丁三醇或含有1,2,4<本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌为，将大肠杆菌基因组上的木糖异构酶基因xylA、木糖激酶基因xylB、2
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脱氢
‑3‑
脱氧葡萄糖酸醛缩酶基因yagE、2
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脱氢
‑3‑
脱氧
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D
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戊酸醛缩酶基因yjhH、磷酸载体蛋白HPr PtsH基因ptsH、PTS酶I基因PtsI I及葡萄糖特异性PTS酶IIBC成分基因ptsG敲除；同时，过表达了来源于乳酸乳球菌的2
‑
酮酸脱羧酶KivD、来源于新月柄杆菌的木糖脱氢酶Xdh和糠醛耐受蛋白；所述糠醛耐受蛋白为来源于大肠杆菌的氧化还原酶ucpA、来源于大肠杆菌的氧化还原酶fucO、来源于大肠杆菌的伴侣蛋白groES和groEL或来源于大肠杆菌的烟酸磷酸核糖转移酶pncB。2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述木糖异构酶XylA基因的Gene ID为：948141；所述木糖激酶XylB基因的Gene ID为：948133；所述2
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脱氢
‑3‑
脱氧葡萄糖酸醛缩酶YagE基因的Gene ID为：944925；2
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脱氢
‑3‑
脱氧
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D
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戊酸醛缩酶YjhH基因的Gene ID为：948825；磷酸载体蛋白HPr PtsH基因的Gene ID为：946886；PTS酶I PtsI基因的Gene ID为：946879；葡萄糖特异性PTS酶IIBC成分PtsG基因的Gene ID为：945651。3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述2
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酮酸脱羧酶KivD基因的Gene ID为：AJ746364；木糖脱氢酶Xdh基因的序列如SEQ ID NO.11所示；所述氧化还原酶ucpA的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述氧化还原酶fucO的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述伴侣蛋白groES的氨基酸序列如SEQ ID NO.3，所述伴侣蛋白groEL的氨基酸序列如SEQ ID...
【专利技术属性】
技术研发人员：诸葛斌，佘丹，陆信曜，宗红，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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