一种减毒沙门菌和噬菌体P22双载体、构建方法及其应用技术

本发明专利技术属于纳米药物领域，具体涉及一种减毒沙门菌和噬菌体P22双载体及其应用，本发明专利技术的减毒沙门菌和噬菌体P22双载体的构建方法包括以下步骤：将形成噬菌体P22衣壳的基因通过质粒载体在减毒沙门菌中进行蛋白表达。本发明专利技术的减毒沙门菌和噬菌体P22双载体可以用于递送异源抗原(如本申请中的PspA)，能激发机体产生强烈的黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫反应，具有显著的免疫保护效果。有显著的免疫保护效果。有显著的免疫保护效果。

【技术实现步骤摘要】
一种减毒沙门菌和噬菌体P22双载体、构建方法及其应用


[0001]本专利技术属于纳米药物领域，具体涉及一种减毒沙门菌和噬菌体P22双载体及其应用。

技术介绍

[0002]噬菌体P22，属于短尾噬菌体科，基因组为双链DNA。其衣壳是由420个CP组装成的二十面体结构，并需要100～330个SP辅助。研究发现，CP和SP异源性表达后，可以组装成直径约50nm的笼状颗粒结构。与化学合成的纳米材料相比，这种蛋白笼结构的纳米材料具有更显著的优势，它们可以通过生物表达系统快速进行大批量生产，其蛋白组成完全清晰、固定。P22衣壳的形成只需要基因5和基因8两种基因的参与，可在内部和外部携带抗原，自组装后的抗原呈多价显示，更有利于诱导B细胞聚集，促进B细胞转化成熟，刺激更强的免疫应答。除此之外，与传统的基于基因工程的病毒载体相比，基于蛋白质的纳米颗粒不含遗传物质，具有更高的安全性。
[0003]以噬菌体P22衣壳为纳米容器，递送抗原蛋白，可适用于针对快速出现的病原体疫苗的生产。Dustin等将流感病毒的NP封装进噬菌体P22衣壳的内部，生产针对流感的疫苗。结果发现，该疫苗对100倍致死剂量的流感病毒提供多重保护。Benjamin等将RSV的基质蛋白(M)和基质蛋白2(M2)封装进P22衣壳中，在小鼠鼻内给药后，颗粒刺激CD8
+
T细胞对两种抗原的记忆反应。此外，疫苗接种引发T细胞群在组织中浸润。随后进行RSV的攻毒，P22
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M/M2处理的小鼠的肺病毒滴度显著降低。这表明P22衣壳在引导针对多种包膜病毒抗原的免疫反应中的效用，证明该技术在促进同时针对多个靶标的免疫方面具有一定潜力。Li等将卵清蛋白(OVA)的B、T表位肽作为模型抗原，分别与P22衣壳蛋白的C端融合，使其展示在衣壳表面，形成P22
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OVA
B
纳米颗粒和P22
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OVA
T
纳米颗粒疫苗。P22
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OVA
B
纳米颗粒可诱导小鼠产生针对肽抗原的高效价抗体，P22
‑
OVA
T
纳米颗粒能诱导高效的抗原交叉递呈反应，并激活T表位特异性CTL免疫反应。在肿瘤模型中，免疫后的小鼠的肿瘤增长速度明显减缓。
[0004]以Dec作为媒介将病原性抗原连接P22衣壳外部的研究较少。Benjamin等尝试使用来自噬菌体L的三聚体修饰蛋白(Dec)作为P22噬菌体展示复杂蛋白的工具。为了检测Dec表达大多聚体蛋白的可能性，他们从小鼠胸腺cDNA源克隆了鼠CD40L(112～260AA)的148个AA可溶区，并与Dec蛋白的C末端融合形成Dec
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CD40L融合构建体。结果发现以Dec作为展示工具，P22递送的CD40L能够正确进行蛋白折叠，对B淋巴细胞具有很高的亲和力。
[0005]沙门菌是一种兼性胞内寄生菌，能引起黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫应答，易于接种，是递送重组蛋白疫苗的一种理想载体。减毒沙门菌作为载体递呈外源性抗原具有的优点有：
①
减毒沙门菌既可携带原核表达质粒也可携带真核表达质粒；
②
减毒沙门菌可入侵至淋巴系统，运送抗原效率高，能更有效地激发体液免疫和细胞免疫；
③
接种简便，通过自然感染途径(如口服或滴鼻)，即可激发黏膜免疫反应，阻止病原在黏膜表面定居和繁殖；
④
减毒沙门菌具有免疫佐剂作用。近年来研究最多的是沙门菌LPS，LPS的刺激可以增强DC捕获和加工MHC I类抗原的能力，有利于将重组沙门菌表达的抗原快速呈递给B、T细胞；
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免疫具有持续性和多联性，减毒沙门菌作为载体侵入宿主体内后，在一段时间内有限增殖，其表达的异源蛋白可对宿主产生持续刺激，可长期激发机体产生免疫反应。并且可以将多种抗原克隆到同一个质粒上进行表达，进行联合免疫。
⑥
重组减毒沙门菌疫苗制备简单，易于储存和运输，且不需要纯化抗原，因此疫苗的成本相对较低。
[0006]减毒沙门菌作为活菌载体表达布鲁氏菌核糖体蛋白L7/L12，具有高度免疫原性，Amal等将L7/L12连接bla信号肽，克隆到P
trc
启动子的质粒上转入减毒沙门菌中表达抗原，构建疫苗株。在动物单次免疫后发现，疫苗株成功激发了布鲁氏菌抗原特异性体液和细胞免疫反应，攻毒后，小鼠脾脏、肝脏等组织中布鲁氏菌的定殖显著减少，使被免疫小鼠免受布鲁氏菌的侵染。减毒沙门菌在细菌类传染病的预防中起到很显著的作用，Pei等将使用减毒沙门菌递送病毒性抗原发现，也同样能产生显著的保护效果。spiR基因是沙门菌SPI
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2基因表达的必须基因，该研究将SL7207基础上将spiR基因缺失，构建新的减毒沙门菌SL368，用于高致病性H5N1流感病毒的血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)的表达和递送。结果表明，以减毒沙门菌为基础的口服疫苗在小鼠中诱导了大量HA特异性IgG、IgA以及IFN
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γ的产生，小鼠产生了显著的抗H5N1免疫保护效果，对H1N1也产生了较好的交叉免疫保护效果。类似的一系列研究为使用减毒沙门菌作为载体研制口服活疫苗提供了设计思路和应用价值。
[0007]肺炎链球菌(S.pneumoniae)是一种条件性致病的胞外菌，革兰阳性球菌，兼性厌氧，主要通过飞沫传播并定殖于人上呼吸道器官的黏膜表面。1881年，G.M.Sternberg和Louis Pasteu在肺炎病人的痰液中分离获得。PspA是与肺炎球菌表面脂磷壁酸中的胆碱残基和细胞壁磷壁酸产生非共价结合的表面蛋白，能与抗体作用。PspA在各种血清型的肺炎链球菌细胞壁表面均存在，是肺炎链球菌毒性所必需的。它能与先天免疫分子乳铁蛋白结合，从而增强肺炎链球菌在机体的毒性。还可以抑制补体在细菌表面的沉积，促进细菌在机体内的繁殖。该蛋白的N端卷曲区域在小鼠体内可引发抗体介导的保护性免疫反应，使小鼠免受肺炎链球菌的感染。已经有研究证明，肺炎链球菌无论是在机体的鼻咽部定殖，还是侵袭性感染，PspA激发机体的免疫保护效果十分明显，是蛋白免疫类疫苗的较优选择。PspA也多被用来作为模式抗原进行新型疫苗载体的评估，如基于体内调控细菌
Ⅵ
型分泌蛋白的减毒沙门氏菌裂解系统的评估；双质粒系统在减毒沙门菌中递送异源性抗原的评估；使用沙门菌OMVs递送异源性抗原的评估等。
[0008]随着重组减毒沙门菌疫苗(RASV)的研究越来越深入，减毒沙门菌在机体内的附着机制愈加清楚，当其穿越机体屏障进入肠道组织后，能够进行有限的复制并侵入淋巴组织，诱发机体产生强烈且持续的免疫反应。RASV已经发展成为了一种高效递送异源性抗原的平台，能刺激机体产生较强的黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫反应。噬菌体P22衣壳的内部和外部均具有一定的异源抗原装载能力，装载后形成的衣壳颗粒为纳米级别，形态均一，能同时装载多个抗原分子，能够诱发机体产生强烈的体液免疫和细胞免疫。本专利技术将P22衣壳相本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种减毒沙门菌和噬菌体P22双载体的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：将形成噬菌体P22衣壳的基因通过质粒载体在减毒沙门菌中进行蛋白表达。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述噬菌体P22衣壳的基因包括：基因5和基因8。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述减毒沙门菌包括减毒沙门菌χ9241。4.权利要求1
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3任一项所述的构建方法构建得到的减毒沙门菌和噬菌体P22双载体。5.权利要求4所述的减毒沙门菌和噬菌体P22双载体在递送异源抗原的应用。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述减毒沙门菌和噬菌体P22双载体递送异源抗原的...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘青，孔庆科，张锐，陈瑾，陈信，唐子芸，
申请(专利权)人：重庆微纳生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：