一种清除双歧杆菌抗性质粒的基因编辑工具及其应用方法技术

本发明专利技术涉及一种清除双歧杆菌抗性质粒的基因编辑工具及其应用方法，基因编辑工具含有两个sgRNA的基因编辑质粒，其中每个质粒包括用于编辑目的基因的sgRNA1和诱导表达靶向质粒中抗性基因、用于消除质粒的sgRNA2，在实施基因编辑过程中，由编辑目的基因的sgRNA1实现基因敲除，编辑完毕后，加入诱导剂以启动靶向质粒中抗性基因的sgRNA2的表达，从而实现基因编辑质粒消除。与现有技术相比，本发明专利技术通过采用CRISPR系统，能够有效消除双歧杆菌中的抗性质粒，通过Cas9蛋白对抗性基因的切割造成质粒双链断裂，最终可获得抗性质粒完全消除的稳定菌株，具有简单有效，设备要求与成本较低，质粒清除率高等特点。清除率高等特点。清除率高等特点。

【技术实现步骤摘要】
一种清除双歧杆菌抗性质粒的基因编辑工具及其应用方法


[0001]本专利技术涉及基因编辑
，尤其是涉及一种清除双歧杆菌抗性质粒的基因编辑工具及其应用方法。

技术介绍

[0002]基因编辑方法可对基因组进行有效遗传修饰和改造，已被广泛地应用于多种物种的基础科研和应用研究。通过基因编辑的手段，大量满足不同需求的菌株被成功构建。经典的细菌基因组编辑方法是基于噬菌体重组酶的同源重组方法。但该方法需要进行两次重组过程，重组效率较低，且需要引入筛选标记。在编辑多个的基因时，易受到筛选标记不足的限制。基因编辑完毕后仍需去除筛选标记，尽管已有多种去除方法，但去除效率难以实现100％，因此需要在反复传代过程中进行单克隆的分离以及验证。这些使得现有方法费时费力。虽然包含锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)、转座子诱变、RNA干扰(RNAi)和反义RNA方法在内的基因编辑手段也得以发展，但仍存在费时费力的弊端。近些年，基于细菌自有免疫系统的CRISPR
‑
Cas9系统得到广泛应用，促进了细菌基因组遗传修饰和表达调控的发展。具有高效切割活性的Cas核酸酶蛋白可导致基因组的双链断裂，只有具有同源模板且重组成功的细胞才能存活和成功编辑。但是当靶向不同目标基因时，需要引入不同的向导RNA(sgRNA)，因此在完成前一轮基因编辑之后，需要去除旧的sgRNA表达质粒，再引入新的sgRNA表达质粒。
[0003]通过物理或化学方法去除质粒存在清除效率低，效果不稳定，且化学试剂的毒性可能对基因组造成不可预料的突变。而目前通过在无抗培养基的反复传代实现质粒消除的方法，虽然被广泛使用但该过程耗时且无法保证100％的效率，最后依然需要挑取单克隆进行纯化并逐个验证，因此，分子生物学手段消除质粒的方法更有优势。
[0004]综上，现有的技术方案均需要去除筛选标记或者消除质粒的步骤，且由于消除效率难以保证100％，又需要额外的挑取单克隆和验证步骤，该过程耗时费力，反复培养也会增加基因组自发突变的风险。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种清除双歧杆菌抗性质粒的基因编辑工具及其应用方法，基于CRISPR
‑
Cas9系统，设计含有两个向导RNA(guide RNA，gRNA，也称为小向导RNAsmall guide RNA，sgRNA，本专利统一为向导RNA，sgRNA)的基因编辑质粒(pLJ系列)，该系列质粒除能表达用于基因编辑的sgRNA1外，还额外诱导表达靶向质粒中抗性基因的sgRNA2，从而具有消除质粒的特性。
[0006]本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：
[0007]本专利技术提供一种清除双歧杆菌抗性质粒的基因编辑工具，所述的基因编辑工具为含有两个sgRNA的基因编辑质粒，其中每个质粒包括sgRNA1和sgRNA2，
[0008]所述的sgRNA1的启动子为人工合成强启动子P23，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所
示，用于编辑目的基因；
[0009]所述的sgRNA2的启动子为PlacZ，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，用于诱导表达靶向质粒中抗性基因，消除质粒。
[0010]在实施基因编辑过程中，由编辑目的基因的sgRNA1实现基因敲除，编辑完毕后，加入诱导剂(例如乳糖)以启动靶向质粒中抗性基因的sgRNA2的表达，从而实现基因编辑质粒消除。
[0011]在本专利技术的一个实施方式中，所述的sgRNA2片段与sgRNA1片段在质粒中分别被靶基因同源片段隔开，隔开的目的在于减少同源重组。
[0012]本专利技术还提供所述的清除双歧杆菌抗性质粒的基因编辑工具的制备方法，包括以下操作步骤：
[0013]S1、扩增sgRNA2的启动子PlacZ片段：以双歧杆菌为模板，DNA聚合酶扩增得到sgRNA2的启动子PlacZ片段；以pLJ2为模板扩增sgRNA2；
[0014]S2、构建sgRNA2表达盒特异性片段：以PCR产物PlacZ片段和sgRNA2等摩尔比为模板，通过重叠PCR(overlap PCR)扩增，得到sgRNA2表达盒特异性片段；
[0015]S3、获得线性化载体：以pLJ2为模板经过限制性内切酶XhoⅠ在37℃下单酶切后的纯化产物为线性化载体；
[0016]S4、构建质粒：利用无缝克隆试剂盒将扩增的sgRNA2表达盒特异性片段与线性化载体拼接到一起，并且热激法转化到大肠杆菌Top10感受态，并利用氨苄青霉素及对应引物进行菌落PCR筛选阳性转化子，得到含有两个sgRNA的基因编辑质粒，即清除双歧杆菌抗性质粒的基因编辑工具。
[0017]在本专利技术的一个实施方式中，步骤S1中，以双歧杆菌为模板，DNA聚合酶扩增得到sgRNA2的启动子PlacZ片段时，上游引物为5
’‑
TATGCAAAACTACAGGCCGTCTCCTTTGCCTCC
‑3’
，下游引物为5
’‑
AATCCACGGCGGTCCTCGAGGCGGCCGCATAACTTCACTAGTATAGCGTGCGG
‑3’
。
[0018]在本专利技术的一个实施方式中，步骤S1中，以pLJ2为模板扩增sgRNA2时，上游引物为5
’‑
CGTCAGACATGGGCACTAGTCTCGAGAAAAAAAGCACCGACTCGGTGC
‑3’
，下游引物为5
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GGCAAAGGAGACGGCCTGTAGTTTTGCATAATTTAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGG
‑3’
。
[0019]在本专利技术的一个实施方式中，步骤S2中以PCR产物PlacZ片段和sgRNA2等摩尔比为模板，通过重叠PCR扩增时，上游引物为5
’‑
CGTCAGACATGGGCACTAGTCTCGAGAAAAAAAGCACC GACTCGGTGC
‑3’
，下游引物为5
’‑
AATCCACGGCGGTCCTCGAGGCGGCCGCATAACTTCACTAGTATAGCGTGCGGG
‑3’
。
[0020]在本专利技术的一个实施方式中，步骤S2中所述sgRNA2表达盒特异性片段由双歧杆菌内源诱导型启动子PlacZ调控。
[0021]在本专利技术的一个实施方式中，步骤S3中，pLJ2原始载体为pAM1，通过添加Cas9表达盒和sgRNA表达盒以及靶基因同源臂后组成为新的质粒，命名为pLJ2。
[0022]在本专利技术的一个实施方式中，步骤S4中含有两个sgRNA的基因编辑质粒携带红霉素抗性基因表达模块以及用于质粒消除的sgRNA2表达盒，其中红霉素抗性基因编码区序列为TAAATTATGCAAAACTACAG。
[0023]在本专利技术的一个实施方式中，步骤S4中，利用无本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种清除双歧杆菌抗性质粒的基因编辑工具，其特征在于，所述的基因编辑工具为含有两个sgRNA的基因编辑质粒，其中每个质粒包括sgRNA1和sgRNA2，所述的sgRNA1的启动子为人工合成强启动子P23，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，用于编辑目的基因；所述的sgRNA2的启动子为PlacZ，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，用于诱导表达靶向质粒中抗性基因，消除质粒。2.根据权利要求1所述的一种清除双歧杆菌抗性质粒的基因编辑工具，其特征在于，所述的sgRNA2片段与sgRNA1片段在质粒中分别被靶基因同源片段隔开。3.一种如权利要求1
‑
2中任一所述的清除双歧杆菌抗性质粒的基因编辑工具的制备方法，其特征在于，包括以下操作步骤：S1、扩增sgRNA2的启动子PlacZ片段：以双歧杆菌为模板，DNA聚合酶扩增得到sgRNA2的启动子PlacZ片段；以pLJ2为模板扩增sgRNA2；S2、构建sgRNA2表达盒特异性片段：以PCR产物PlacZ片段和sgRNA2等摩尔比为模板，通过重叠PCR扩增，得到sgRNA2表达盒特异性片段；S3、获得线性化载体：以pLJ2为模板经过限制性内切酶XhoⅠ在37℃下单酶切后的纯化产物为线性化载体；S4、构建质粒：利用无缝克隆试剂盒将扩增的sgRNA2表达盒特异性片段与线性化载体拼接到一起，并且热激法转化到大肠杆菌Top10感受态，并利用氨苄青霉素及对应引物进行菌落PCR筛选阳性转化子，得到含有两个sgRNA的基因编辑质粒，即清除双歧杆菌抗性质粒的基因编辑工具。4.根据权利要求3所述的一种清除双歧杆菌抗性质粒的基因编辑工具的制备方法，其特征在于，步骤S1中，以双歧杆菌为模板，DNA聚合酶扩增得到sgRNA2的启动子PlacZ片段时，上游引物为5
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TATGCAAAACTACAGGCCGTCTCCTTTGCCTCC
‑3’
，下游引物为5
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AATCCACGGCGGTCCTCGAGGCGGCCGCATAACTTCACTAGTATAGCGTGCGG
‑3’
；步骤S1中，以pLJ2为模板扩增sgRNA2时，上游引物为5
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CGTCAGACATGGGCACTAGTCTCGAGAAAAAAAGCACCGACTCGGTGC
‑3’
，下游引物为5
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GGCAAAGGAGACGGCCTGTAGTTTTGCATAATTTAGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGG
‑3’
；步骤S2中以PCR产物PlacZ片段和sgRNA2等摩尔比为模板，通过重叠PCR扩增时，上游引物为5
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CGTCAGACATGGGCAC...

【专利技术属性】
技术研发人员：艾连中，宋馨，熊智强，夏永军，王光强，
申请(专利权)人：上海理工大学，
类型：发明
国别省市：