低内毒素含量的罗氏真养菌及其应用制造技术

本发明专利技术涉及微生物技术领域，具体涉及低内毒素含量的罗氏真养菌及其应用。本发明专利技术提供罗氏真养菌H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表达和/或酶活性降低在降低罗氏真养菌的内毒素含量中的应用。本发明专利技术发现罗氏真养菌H16_A0228、H16_B0917蛋白的失活能够明显降低罗氏真养菌的内毒素含量。H16_A0228蛋白、H16_B0917蛋白功能缺失的工程化罗氏真养菌不仅内毒素含量显著降低，同时其细胞干重和PHA产量显著提高，为PHA的工程化菌株的开发提供了新的基因和菌株资源，为降低PHA的内毒素含量提供了有效方法，对于拓展PHA在医疗材料中的应用具有重要意义。用具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
低内毒素含量的罗氏真养菌及其应用


[0001]本专利技术涉及微生物
，具体涉及低内毒素含量的罗氏真养菌及其应用。

技术介绍

[0002]内毒素是多数革兰氏阴性菌细胞外膜的一种成分，细胞外膜是一种不对称的脂质双层，主要由作为内层的磷脂和作为外层的脂多糖组成。脂多糖则由疏水性的脂质A(Lipid A)、亲水性的非特异性核心多糖(Core polysaccharides)和长链的O抗原多糖(O
‑
antigen)组成，核心多糖含有一个外己糖区域和一个内庚糖区域，分别与特异性多糖和脂质A相连，长链的O抗原多糖赋予菌株一种特异性表面抗原，由重复的寡糖亚基组成，脂质A则是引起内毒素毒性的关键成分。已有文献报道脂质A缺陷对大多数其他革兰氏阴性细菌是致命的(Clementz,T.Inhibition of lipopolysaccharide biosynthesis and cell growth following inactivation of the kdtA gene in Escherichia coli.[J].Journal of Biological Chemistry,1995,270(46):27646.)。
[0003]聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates，PHA)是一类由微生物合成的高分子聚合物，具有多元材料学性能，在医疗、农业、环保、化工等领域都得到了广泛的应用，尤其在医疗材料领域，由于其具备优异的材料性能，被认为是一种具有广阔应用前景的材料。然而生物合成的PHA不能直接和人体接触，必须除去热原成分(如内毒素)才是能达到医用级的PHA 材料。
[0004]罗氏真养菌(Ralstonia eutropha，又名Cupriavidus necator)，是革兰氏阴性菌中的一种，也是可用于合成PHA的菌株之一。然而PHA材料中残留的内毒素(endotoxin)极大地限制了PHA在医疗材料中的应用，因此纯化后的PHA需要最大限度的降低内毒素的含量。目前尚未发现对罗氏真养菌进行基因改造以降低其内毒素含量的报道。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的之一是提供在罗氏真养菌中降低内毒素的含量的方法。本专利技术的另一目的是提供一种降低内毒素含量的工程化罗氏真养菌。
[0006]本专利技术以罗氏真养菌为研究对象，开发通过基因工程改造降低其内毒素含量的方法。在研发过程中，本专利技术发现，罗氏真养菌的脂质A的分子量、脂肪酸链结构等化学结构与大肠杆菌等其他革兰氏阴性菌存在较大差异，例如：罗氏真养菌的脂质A多出一个4
‑
氨基
‑4‑
脱氧
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L
‑
阿拉伯糖，而且罗氏真养菌的脂肪酸链的一级酰基链为C14，且同时在2和2
’
位置各产生一条二级酰基链，二级酰基链也均为C14(大肠杆菌的一级酰基链为C14，二级酰基链中有一条是C12)。而目前发现的革兰氏阴性菌脂质A的脂肪酸链的合成酶普遍具有底物特异性，不同长度脂肪酸链的合成由不同的酶催化(例如月桂酰转移酶催化C12脂肪酸链的合成，豆蔻酰转移酶催化C14脂肪酸链的合成)。由此推知罗氏真养菌中参与脂质A及其脂肪酸链的合成的酶及其合成、调控机制可能与大肠杆菌等其他革兰氏阳性菌明显不同，但目前尚未见关于罗氏真养菌中脂质A及其脂肪酸链的合成途径和相关酶的报道。
[0007]此外，本专利技术在研发过程中曾尝试在罗氏真养菌利用现有技术公开的降低大肠杆菌、百日咳杆菌等革兰氏阴性菌的内毒素毒性或含量的方法，例如：敲除用于调控脂肪酸链转移到脂质A的碳骨架上msbB和pagP基因同时过表达Francisella tularensis来源的内膜磷酸酶lpxEft以改变脂质A的结构，以及，表达来自铜绿假单胞菌来源的酰基转移酶LpxDpa、LpxApa以使得不同位置酰基链长度改变，但是，上述方法均无法在罗氏真养菌中实现降低内毒素含量的目的，进一步证明了罗氏真养菌中脂质A及其脂肪酸链的化学结构特征导致其合成酶及其合成、调控机制可能与大肠杆菌等其他革兰氏阳性菌明显不同。
[0008]经不断尝试，本专利技术意外地发现，罗氏真养菌H16_A0228蛋白、H16_B0917蛋白的弱化或敲除能够显著降低其内毒素的含量，而且，还有利于PHA产量和生物量的提升。
[0009]具体地，本专利技术提供以下技术方案：
[0010]第一方面，本专利技术提供罗氏真养菌H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表达和/或酶活性降低在降低罗氏真养菌的内毒素含量中的应用。
[0011]第二方面，本专利技术提供罗氏真养菌H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表达和/或酶活性降低在提高罗氏真养菌的PHA产量中的应用。
[0012]第三方面，本专利技术提供罗氏真养菌H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表达和/或酶活性降低在提高罗氏真养菌的生物量中的应用。
[0013]第四方面，本专利技术提供罗氏真养菌H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表达和/或酶活性降低在降低罗氏真养菌的内毒素含量同时提高罗氏真养菌的PHA产量和生物量中的应用。
[0014]在本专利技术的一些实施方式中，本专利技术提供罗氏真养菌H16_A0228蛋白的表达和/或酶活性降低在降低罗氏真养菌的内毒素含量、提高罗氏真养菌的PHA产量和/或提高罗氏真养菌的生物量中的应用。
[0015]在本专利技术的一些实施方式中，本专利技术提供罗氏真养菌H16_B0917蛋白的表达和/或酶活性降低在降低罗氏真养菌的内毒素含量、提高罗氏真养菌的PHA产量和/或提高罗氏真养菌的生物量中的应用。
[0016]在本专利技术的一些实施方式中，本专利技术提供罗氏真养菌H16_A0228蛋白和H16_B0917蛋白的表达和/或酶活性降低在降低罗氏真养菌的内毒素含量、提高罗氏真养菌的PHA产量和/或提高罗氏真养菌的生物量中的应用。
[0017]上述应用中，生物量的提高可表现为细胞干重的提高。
[0018]本专利技术中，H16_A0228、H16_B0917为蛋白的编码基因在GenBank中的locus_tag，在GenBank中可获得H16_A0228、H16_B0917蛋白及其编码基因的序列。
[0019]具体地，H16_B0917蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.3所示，H16_B0917蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。H16_A0228蛋白的编码基因序列如SEQ ID NO.5所示，H16_A0228蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0020]H16_B0917蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.4)具体如下：
[0021]MKHRLQAALTIAVFKLVAALPYGVTARLGDAIGKLLYRIPSRRRRIVHTNLSLCFPDMDADTRDKLARNHFGHVLRSYLERGVQWFGSAERLGKLVELDSRIDLASCA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.罗氏真养菌H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表达和/或酶活性降低在降低罗氏真养菌的内毒素含量中的应用。2.罗氏真养菌H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表达和/或酶活性降低在提高罗氏真养菌的PHA产量中的应用。3.罗氏真养菌H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表达和/或酶活性降低在提高罗氏真养菌的生物量中的应用。4.罗氏真养菌H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表达和/或酶活性降低在降低罗氏真养菌的内毒素含量同时提高罗氏真养菌的PHA产量和生物量中的应用。5.工程化罗氏真养菌，其特征在于，所述工程化罗氏真养菌被修饰以使得其中H16_A0228蛋白和/或H16_B0917蛋白的表达和/或酶活性降低。6.根据权利要求5所述的工程化罗氏真养菌，其特征在于，所述工程化罗氏真养菌中H16_A0228蛋白和...

【专利技术属性】
技术研发人员：丰婧，杨晓妍，尹进，李腾，张浩千，
申请(专利权)人：深圳蓝晶生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：